Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
Долю размывания полосы вне колонки лучше всего установить, получив кривую зависимости h =f(u) для нескольких веществ. Если соединения со значениями к! < 5 дают кривые другой формы, чем соединения с более высоким значением к’, то это указывает на размывание полосы вне колонки. Об этом же говорят формы пиков, например образование хвоста у пиков соединений с небольшими значениями к' и отсутствие хвоста у пиков тех соединений, которые удерживаются сильнее. Если найденная высота, эквивалентная теоретической тарелке, для инертного соединения больше, чем для удерживаемого на колонке, то это также свидетельствует о возможном
Основы хроматографии
31
размывании полосы вне колонки. Самостоятельно изготовленные, как и купленные, приборы особенно после их перестройки всегда следует испытать подобным образом.
3. Оптимальные условия анализа, время анализа
Оптимальными условиями разделения считаются такие условия, когда при наименьшей затрате времени удается добиться максимально возможного разделения [26]; при этом технические трудности должны быть минимальными. Как уже отмечалось, разделение R > >1,5 нежелательно, так как оно достигается только за счет увеличения длительности анализа. Каждой пробе соответствуют своя оптимальная система неподвижной и подвижной фаз и своя определенная температура разделения, отвечающие при заданном разделении наибольшей селективности и соответственно наибольшему относительному удерживанию (а). Всегда следует стремиться подбирать оптимальную систему фаз и оптимальную температуру, так как при этом удается сократить до минимума число теоретических тарелок и соответственно длину колонки.
Необходимое в этих условиях время анализа, соответствующее времени удерживания последнего пика, рассчитывают [26] по уравнению
tR = HN-^(l + k'2). (33)
Время анализа, необходимое для оптимального разделения, зависит от свойств подвижной фазы и от того, с какой скоростью эта фаза будет перемещаться при заданном перепаде давлений. Поэтому всегда следует стремиться выбрать среди нескольких элюент ов со сходными хроматографическими свойствами подвижную фазу с низкой вязкостью.
Свойства разделительной колонки и способ ее заполнения также значительно влияют на длительность анализа. Как уже было сказано, разделительная колонка всегда должна быть более короткой. Минимальная длина колонки лимитируется необходимым числом теоретических тарелок. Как известно, число тарелок обратно пропорционально диаметру частиц в квадрате (или в меньшей степени), поэтому всегда стремятся использовать частицы меньшего размера. Однако с уменьшением размера частиц снижается также проницаемость колонки, и для того, чтобы можно было поддерживать постоянную скорость элюента, приходится повышать давление. Обычные насосы высокого давления позволяют создавать давление порядка 300 - 400 атм, поэтому уменьшать размер частиц и соответственно длительность анализа можно только до определенных пределов. Кроме того, принципиальные ограничения [положение мини-
32
Глава II
мума на кривой h = /(и)], по-видимому, не позволяют работать с частицами, диаметр которых меньше 3—4 мкм (ср. разд. Е).
Температура влияет на длительность анализа только косвенно. Так, с увеличением температуры снижается вязкость подвижной фазы. Благодаря этому при постоянном перепаде давлений увеличивается-скорость элюента. Как известно, коэффициенты диффузии с увеличением температуры также возрастают, поэтому при более высокой температуре получают более острые зоны. Само собой разумеется, что температура влияет также на кинетику и термодинамику удерживания вещества.
Необходимое для разделения число тарелок можно получить и на длинной колонке, заполнив ее большими частицами ( ~ 30 мкм), и на короткой колонке, заполнив ее более мелкими частицами (5 или 10 мкм). Естественно, при этом предполагается, что обе колонки можно одинаково хорошо и воспроизводимо заполнить. В данной ситуации выбор колонки зависит от технических возможностей аппаратуры, например от того, можно ли получить нужную постоянную скорость элюента при давлении, создаваемом насосом. Выбирая размер частиц насадки, следует помнить, что колонка должна быть заполнена в соответствии с предъявляемыми требованиями и что материал насадки должен выдерживать необходимое давление. Если разделение проводят в коротких колонках, важную роль играет аппаратурный мертвый объем, так как объем подвижной фазы в колонке становится сравним с мертвым объемом. В то же время если колонка заполнена мелкими частицами, элюируемые соединения перемещаются по ней в виде очень острых зон и достигают детектора менее разбавленными, чем в более длинных колонках, заполненных частицами большего размера (ср. разд. В), поэтому чувствительность детектирования в первом случае выше. Мерой скорости анализа служит скорость образования теоретических тарелок, т. е. число тарелок, образующихся в секунду. Поскольку разделение двух пиков пропорционально числу эффективных тарелок, то целесообразно в качестве меры скорости анализа использовать число эффективных тарелок, образованных за секунду,
