Нейрохимия - Ашмарин И.П.
ISBN 5-900760-02-2
Скачать (прямая ссылка):
267
терен для мягких солюбилизирующих агентов, таких как тритон Х=100, дезоксихолат натрия, дигитонин и другие, которые позволяют выделять нативные мембранные белки с сохранением их биологической активности. В то же время додецилсуль-фат натрия (ДСН) с высоким коэффициентом мицеллообразо-вания обладает большой связывающей способностью и значительно повреждает нативную конформацию белков. Как правило, этот детергент используется при анализе субъединичной структуры макромолекул, так как легко разрушает межмолеку-лярные связи. Это свойство нередко применяется для определения молекулярной массы субъединиц белков при электрофорезе в присутствии ДСН.
Перед тем как приступить к дальнейшему выделению и изучению мембранных рецепторных белков, следует по возможности более полно удалить избыток детергента, поскольку он может оказывать нежелательное действие на биологическую активность и последующий физико-химический анализ структуры нейрорецептора.
Классические методы исследования мембранных белков, в том числе нейрорецепторов, включают практически все биохимические методы с учетом присутствия детергентов (электрофорез, изоэлектрофокусирование, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматография и др.). Основным приемом специфического выделения ничтожно малых количеств нейрорецепторов является аффинная хроматография, которая позволила добиться впечатляющих успехов в изучении молекулярных свойств самых разнообразных типов нейрорецепторов.
Эффективность аффинной хроматографии зависит преимущественно от выбора лиганда или акцептора, который определяет природу выделяемого мембранного белка. Существенным фактором в этом случае является сродство лиганда к рецептору, и поэтому самыми эффективными лигандами оказываются специфические блокаторы или антагонисты нейрорецепторных белков. Иногда для выделения конкретного белка используют две или три ступени аффинной хроматографии на разных сорбентах и с разными лигандами. Получили широкое распространение методы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда используется поликлональные или моноклональные антитела, полученные к компонентам рецептора.
Дальнейшее выделение и разделение фракций обычно осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, которая позволяет очищать индивидуальные компо-
268
ненты мембранных белков. Причем обратнофазная хроматография дает уникальные возможности по разделению гидрофобных белков и пептидов. Нативность белковых компонентов рецепторов проверяют либо по лигандсвязывающей функции, либо путем реконструкции их функции в разных модельных системах.
Одной из таких модельных систем, позволяющих контролировать ионтранспортные или ионселективные функции нейро-рецепторов, служат липосомы. Способность липосом встраивать белки или целые рецепторные комплексы с сохранением их функциональной активности используется в мембранологии для моделирования функций белков “в чистом виде”. В этом случае можно получать информацию о структурной организации компонентов, составляющих макромолекулу рецептора, и их внутренних перестройках в контролируемых условиях эксперимента.
В настоящее время разработано большое количество методов получения липосом, которые могут изменять фосфолипид-ный состав, заряд, “текучесть” или многослойность их компонентов. Размеры липосом могут варьировать от 25 нм до 100 мкм. Функцию белков, встраиваемых в липосомы, контролируют по динамике транспорта или накопления меченых ионов внутри липосом.
В последние годы исследователи возлагают особые надежды на иммунохимические способы идентификации структурных компонентов нейрорецепторов. Высокая специфичность антител и их способность узнавать разные антигенные детерминанты рецепторных комплексов широко используется для выяснения структурной организации нейрорецепторов и процессов их биосинтеза, включая генно-инженерные исследования. Иными словами, поли- и моноклональные антитела являются важным инструментом для изучения механизмов рецептии и общих вопросов нейробиологии.
Принципиальным решением множества проблем, связанных с применением антител, явилось создание новой гибридомной технологии, которая позволила получить моноклональные антитела. Эта техника была разработана в 1975 г. У. Келлером и А.Милстейном. Получаемые с помощью этого метода гибридные клетки синтезируют и выделяют в культуральную среду антитела, абсолютно одинаковые по своему сродству к той или иной антигенной детерминанте.
Гибридомная техника позволила получать самые разнообразные моноклональные антитела против химически индиви-
269
дуальных антигенных детерминант на одной молекуле белка. В настоящее время моноклональные антитела широко используют для идентификации практически любых макромолекул, включая нейрорецепторы.
Следует подчеркнуть, что изучение структуры и функции нейрорецепторов и других мембранных компонентов нейрона является не самоцелью для нейробиологической науки. Важно понять, как молекулярные процессы, происходящие в нервных клетках, способны интегрировать самую разнообразную информацию и реализовать ее в виде сложных поведенческих, высших психических и эмоциональных реакций. Этот стратегический путь “от простого к сложному” получил в последние годы мощный импульс благодаря разработке принципиально новых способов прижизненной регистрации динамических биохимических реакций, происходящих в клетках головного мозга. Появились методы позитронно-эмиссионной томографии, ядерно-маг-нитного резонанса, гамма-сцинциграфии и другие, позволяющие прижизненно регистрировать системный метаболизм разных органов и тканей, включая головной мозг млекопитающих. Это создает предпосылки для успешного изучения нейрохимических основ формирования разнообразных функциональных состояний живого мозга человека, его наиболее сложной сферы деятельности —психической.
