Нейрохимия - Ашмарин И.П.
ISBN 5-900760-02-2
Скачать (прямая ссылка):
264
торов радиолигандным методом. Так, исследования параметров связывания 3Н-глутамата с синаптическими мембранами, выделенными из коры больших полушарий головного мозга крыс, показали их зависимость от чистоты материала, способов хранения, условий проведения реакции связывания и др. При стандартизации всех указанных условий зависимость специфического связывания 3Н-глутамата с синаптическими мембранами имеет насыщающий характер (рис.8.6). Представление экспериментальных данных в координатах Скэтчарда свидетельствует о наличии на мембранах однородной популяции участков связывания с Кд = 89,4 нМ и Вмакс = 2,0 пмоль/мг белка.
Рис. 8.6. Кривая насыщения и график Скетчарда для глутамат-узнающих участков связывания на солюбилизате синаптических мембран из головного мозга крыс
Значение количества центров связывания (В), выраженное в СРМ (имп/мин), пересчитывается в фмоль/мг белка по следующей формуле:
265
_{CPM,6-CPM.ic„ )
Лиа ¦ f -t С
где — молярная активность радиолиганда, Кю/моль; а — 2,2 10-12 pacn/мин (коэффициент перевода Юо в PM); f — эффективность счета (определяется для каждого сцинтилляцион-ного счетчика); (СРМ^щ — СРМнесп) — разность счета связывания радиолиганда с рецептором в отсутствие (СРМобщ) и в присутствии (СРМН ') немеченого радиолиганда; t — время счета (зависит от выбранной программы обсчета проб); С — концентрация белка, мг.
Для того чтобы отличить эти параметры связывания от неспецифического связывания и поглощения глутамата другими участками мембраны, существуют дополнительные экспериментальные приемы, в том числе проведение реакции в присутствии разных катионов. Истинное рецепторное связывание глутамата является Na+-независимым процессом, в то время как поглощение и транспорт этого нейромедиатора другими участками синапса происходит в присутствии высоких концентраций ионов Na.
Далее возникает вопрос, соответствуют ли эти независимые участки связывания самого глутамата тем рецепторным компонентам на мембране нейрона, которые способны вызывать физиологический ответ клетки на данный медиатор. Оказалось, что сродство и константа диссоциации, полученные экспериментальным биохимическим методом, находятся в пределах физиологических концентраций действия L-глутамата на нейроны позвоночных. Такие показатели реакции связывания нейромедиатора, как насыщаемость и обратимость, соответствуют аналогичным свойствам глутаматного рецептора, регистрируемым с помощью электрофизиологических методов. Более того, чувствительность к ряду известных агонистов и антагонистов, таких как NMDA, каинат, квисквалат и другие, была сходна с физиологическими ответами. Следует упомянуть, что характер связывания нейромедиатора в присутствии ионов Na существенно отличается от рецепторного взаимодействия и коррелирует с параметрами высокоаффинного поглощения L-глутамата клетками, регистрируемыми физиологически. Все это иллюстрирует пути оценки параметров связывания нейромедиатора и специфические трудности, возникающие при такой оценке.
Одним из основных подходов к изучению молекулярных свойств нейрорецепторов является изолирование индивидуальных
266
рецепторных белков, специфически связывающих нейромедиаторы или необратимо взаимодействующих с их антагонистами или бло-каторами. Так, прогресс в исследовании никотиновых холино-рецепторов был обусловлен обнаружением а-бунгаротоксина, который оказался специфическим блокатором этого типа рецепторов и позволил выделить мембранные белки и очистить их на основе радиолигандного метода. Наличие таких приемов дает возможность разграничить хеморецепторные процессы от ферментативного и транспортного метаболизма нейромедиаторов. Особенно это важно для изучения рецепторов аминокислотных медиаторов нервной ткани.
Изучение химической природы мембранных белков включает предварительное выделение, солюбилизацию (экстракцию), очистку и анализ очишенных компонентов. Причем применение классических методов структурного анализа для характеристики мембранных белков имеет свои сложности и особенности. Как правило, они обусловлены свойствами мембран и их компонентов, в частности, наличием липидных и гликолипид-ных структур. Проблемы, связанные с экстракцией белковых компонентов мембран, их очисткой и анализом, составляют специальный раздел мембранологии. Здесь будут рассмотрены лишь самые общие моменты.
Выбор метода солюбилизации зависит от цели исследования и имеет смысл только тогда, когда дает возможность сохранить нативные свойства рецепторного белка и исследовать его с помощью обычных биохимических подходов. Поэтому выбор солюбилизирующего агента на первом этапе может оказаться ключевым для анализа структуры и функции рецептора.
Существует целый ряд самых разнообразных солюбилизирующих агентов, пригодных для решения проблем мембранной биохимии. Наиболее надежными среди них являются неионные и ионные детергенты. В основе их действия лежит амфифиль-ная природа этих агентов, позволяющая им взаимодействовать и с гидрофильными, и с гидрофобными участками мембранных белков. Эффект детергента, разрушающего взаимосвязи в мембране, определяется двумя видами взаимодействия: детергент-белок и детергент—детергент. Большое значение имеет последнее взаимодействие, так как чем выше способность молекул детергента взаимодействовать друг с другом, тем меньше будет количество молекул, способных взаимодействовать с белками. Этот критерий мицеллообразования служит характеристикой детергента и его способности растворять те или иные белковые компоненты. Низкий коэффициент мицеллообразования харак-
