Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
правил интерпретации сдвигов продуктов гидролиза относительно более короткого сегмента в зависимости от природы добавленного звена, разработанных Ту и By [278], определяется первичная структура исследуемого олигонуклеотида. Природа первого звена — 5'-мононуклеотида определяется независимым методом. Применение рассмотренного способа определения специфичности рестриктаз основывается на том, что большинство рестриктаз расщепляют палиндромный сайт симметрично и в пределах узнаваемого участка. Таким образом после расщепления все ДНК-фрагменты имеют гомологичные концевые участки. Протяженность этих участков в 3'- и 5'-направлениях будет за-висить от размеров узнаваемого участка и от способа его расщепления. Например, шестизвенный Hind III сайт (5'A*AGCTT) после расщепления образует пятизвенную 5'-концевую гомологичную последовательность, а всем З'-концевым последовательностям единственным гомологичным звеном будет адениновый нуклеотид, т. е. во втором случае размеры общего участка будут минимальными. В случае рестриктазы Kpn I, узнающей и расщепляющей S'GGTAC^C последовательность, будет наблюдаться противоположная картина, то есть образуется пятизвенный З'-концевой гомологичный участок и минимальный 5'-концевой. Величина гомологичной части при использовании метода фин-герпринтирования имеет важное значение, так как пометить можно любой из концов ДНК-фрагментов. Однако, введение 5'-концевой метки при помощи Т4-полинуклеотидкиназы в рестрикционные фрагменты Kpn I (5'GGTAC+C) или, в 3' конец фрагментов полученых под действием Hind III (5'A^AGCTT) при помощи обычно с этой целью используемой терминальной дез-оксинуклеотидилтрансферазы [135], представляется нецелесообразным, так как фингерпринт не дает нужной информации. В общем случае, когда отсутствует информация о структуре липких концов, что обычно имеет место при исследовании нового фермента, выбор того или иного способа введения метки несет определенную степень риска. С другой стороны существует ряд обстоятельств, позволяющих свести такой риск до минимума. Во-первых, количество рестриктаз образующих З'-высту-пающие фрагменты значительно меньше тех, которые образуют б'-выступающие или спареные концы, что указывает на предпочтительное использование 5'-киназной метки. Во-вторых, на предварительном этапе работы иногда можно получить информацию о предполагаемом месте расщепления. Для этого перед фингерпринтированием можно проанализировать концевой мононуклеотид, акцептирующий радиоактивную метку. Косвенным указанием на ожидаемое место расщепления также может служить специфичность известного прототипа.
Благодаря простоте исполнения и информативности метод фингерпринтирования широко применяется для анализа специфичности рестриктаз. В качестве примера можно перечислить
целый ряд рестриктаз, специфичность которых была определена этим методом: Alu I [219] ВашН I [221], Mbo I [101], Sau3A I [264], Pvu II [63] и др. [46, 100, 265, 277].
В тех случаях, когда продукты рестриктазной реакции имеют полностью спаренные концы, анализ 5'-концевой последовательности дает информацию лишь о структуре половины сайта. В отсутствии сведений об узнаваемом участке, полученных независимыми методами (например, косвенными), для большей достоверности анализ З'-коицов является необходимым. Чаще всего для этой цели используется метод анализа ближайших соседей. В таких случаях применение ДНК полимеразы Т4, благодаря присущих ей полимеразной и экзонуклеазной ак-
тивностей, позволяет в присутствии меченных нуклеозидтрифос-фатов ввести 32Р-меченый З'-концевой нуклеотид. После гидролиза рестриктов соответствующими фосфодиэстеразами и анализа продуктов реакции определяется ближайший сосед включенного меченого предшественника [99, 166]. В результате такого анализа устанавливается структура З'-концевого динуклеотида рестрикционного фрагмента. Обсуждаемый методический подход нашел применение в экспериментах по определению субстратной специфичности рестриктаз Xma I [92] и Hind III [195].
Метод матричного копирования ДНК при помощи полимеразы иногда используется и для анализа рестрикционных фрагментов с б'-выступающими концами. С этой целью проводится серия опытов, где З'-конец фрагмента достраивается полимеразой в присутствии одного меченого и остальных немеченых предшественников. Анализ ближайших соседей позволяет установить не только включаемый нуклеотид, но и последовательность их включения. Этим методом была подтверждена структура узнаваемого участка и определено место расщепления для рестриктаз SalG I [31], Xba I [303] и ВашН I [221].
В тех случаях, когда рестриктаза расщепляет ДНК с образованием З'-выступающих концов, 5'-киназная метка фрагментов позволяет определить лишь меньшую часть узнаваемой последовательности. Для полной идентификации сайта необходимо провести анализ З'-концевой структуры рестриктов. Робертсом [217] было предложено в таких случаях для введения З'-концевой метки использовать терминальную трансферазу. Практически этот подход впервые был реализован в опытах по определению специфичности рестриктазы Kpn I [274]. Анализ З'-меченой ДНК проводится как и в случае 5'-концевой метки, с той лишь разницей, что для получения продуктов частичного гидролиза используются микрококковая нуклеаза и фосфо-диэстераза селезенки, т. е. нуклеазы, расщепляющие ДНК с образованием З'-фосфатов.
