Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для подтверждения предполагаемой субстратной специфичности предлагается применять: 1) совместную обработку субстрата исследуемым ферментом и предполагаемым прототипом (в случае доступности), 2) определение числа и величин фрагментов, образующихся в результате действия исследуемого фер-
мента на стандартные ДНК и сравнение полученных данных с рассчитанными на основе известной последовательности нуклеотидов этих ДНК и структуры предполагаемого сайта узнавания, 3) два варианта метода картирования — точное и относительное.
Относительное картирование заключается в обработке субстратов с известной первичной структурой исследуемым ферментом в смеси с некоторыми известными рестриктазами и сравнение величин полученных фрагментов с расчетными. Относительное картирование с методической точки зрения ничем не отличается от точного. И в этом и в другом случае проводится обработка субстрата смесью исследуемого фермента с известными (попарно) и определение величин получаемых фрагментов. Путем логических рассуждений с учетом координат участков, узнаваемых использованными в опытах рестриктазами с известной субстратной специфичностью, можно определить местоположение точек, расщепляемых исследуемым ферментом. Однако, в тех случаях, когда проверяется субстратная специфичность новой рестриктазы, предсказанная на основе других опытов, в этом нет необходимости, так как координаты ее предполагаемого участка узнавания относительно сайтов расщепления известных рестриктаз могут быть рассчитаны на основе данных о первичной структуре используемых субстратов. Сравнение расчетных данных с экспериментальными сразу без дополнительных рассуждений дает ответ, является ли предполагаемая последовательность нуклеотидов субстратом исследуемого фермента. Кроме того, в этом случае допустима обработка субстрата не всеми комбинациями: известные рестриктазы — исследуемая, необходимыми для точной локализации точек расщепления последней. Это тоже снижает трудоемкость экспериментов. Учитывая тот факт, что таким способом проверяется относительное расположение многих сайтов узнавания, надежность определения субстратной специфичности исследуемой рестриктазы методом относительного картирования является высокой.
4.2. Методы определения места расщепления субстрата
С применением косвенных методов удается определить только первичную структуру узнаваемой последовательности. Для того чтобы установить место расщепления фосфодиэфирной связи, необходимо использовать прямые методы структурного анализа ДНК. Очевидно, что задача определения места разрыва, когда известны структурные особенности узнаваемой последовательности, значительно упрощается.
Для определения субстратной специфичности первой открытой рестриктазы II типа — Hind II [144] было использовано введение метки в 5'-концы фрагментов ДНК, генерируемых ис-
следуемым ферментом, при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4 в присутствии [Т—32Р] АТФ с последующим анализом их структуры. С этой целью меченые фрагменты обрабатывали ферментами в условиях, обеспечивающих их гидролиз до мононуклеотидов (фосфодиэстеразой змеиного яда) или позволяющих получать набор ди-, три-, тетра- и т. д. олигонуклеотидов (обработка панкреатической ДНК-азой). Продукты частичного гидролиза выделяли и осуществляли анализ первичной структуры каждого индивидуального меченого олигонуклеотида. Анализ З’-концевого динуклеозидмонофосфата, полученного гидролизом равномерно меченых ДНК-рестриктов микрококковой нуклеазой, позволил установить З'-концевую структуру Hind II фрагментов. На основе совокупности полученных данных оказалось возможным определить последовательность нуклеотидов, узнаваемую исследуемым ферментом, и также способ расщепления субстрата. Аналогично была определена специфичность рестриктазы EcoR I [265], Hind III [195], EcoR II [45] и ряда других эндонуклеаз. Рассмотренные выше аналитические приемы отличались громоздкостью и трудоемкостью. В настоящее время они представляют только исторический интерес.
Со времени открытия первых представителей рестриктаз II типа, как и в случае исследования сайтовой специфичности, методы определения места расщепления постоянно совершенствовались. Происходило это в основном благодаря бурному развитию методов анализа первичной структуры олигонуклеотидов и полинуклеотидов, а также появлению возможности быстро синтезировать олигонуклеотиды любой длины и последовательности. Все новейшие достижения в области синтеза и анализа нуклеиновых кислот быстро адаптировались для определения специфичности рестриктаз.
Метод фингерпринтирования. Разработке метода «отпечатков пальцев» («fingerprint») известного также под названием метода «блуждающего пятна» («wondering spot»), способствовало появление и накопление данных о поведении коротких олигонуклеотидов в различных условиях тонкослойной хроматографии и электрофореза, а также определение закономерностей подвижности олигонуклеотидов в зависимости от состава оснований. Суть его заключается в последовательном двухмерном разделении продуктов статистического экзонуклеазного гидролиза исследуемого олигонуклеотида, содержащего концевую изотопную метку, при помощи сначала электрофореза, потом анионообменной хроматографии в тонком слое ДЭАЭ-цел-люлозы. Разделение по первому направлению проводится в кислом буфере, что позволяет проявиться нуклеотидному составу каждого из продуктов статистического гидролиза. Разделение по второму направлению происходит только в зависимости от длины продуктов гидролиза. После авторадиографии, по относительному расположению радиоактивных пятен и с учетом
