Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Исключительная значимость рестриктаз как аналитических реагентов на долгое время определило развитие исследований в этой области в основном в сторону решения прикладных задач, которые реализовывались путем поиска новых продуцентов, очистки и характеристики субстратной специфичности открытых ферментов. В ходе этих экспериментов, вне зависимости от поставленных целей, были накоплены данные касающиеся вопросов распространения рестриктаз и вариабильности характеристик проявления их специфичности. Со временем все больше внимания стало уделяться углубленному и целенаправленному изучению вышеупомянутых, а также некоторых других вопросов, имеющих фундаментальное общепознавательное значение. Среди последних можно упомянуть исследование структуры генов кодирующих рестриктазы, физико-химических и энзиматических характеристик рестриктаз, изучение молекулярных механизмов белок-нуклеинового узнавания. Указанные направления исследований далеки от завершения и находятся на разных стадиях развития. Можно прогнозировать, что они, а также
белковая инженерия ферментов рестрикции-модификации с целью изменения их специфичности, в ближайшем десятилетии будут магистральными направлениями фундаментальных исследований в обсуждаемой области науки. В настоящем обзоре основное внимание будет уделено рассмотрению вышеперечисленных вопросов. Значительная часть исследований в области изучения рестриктаз посвящена экспериментам, имеющим более выраженное прикладное значение (поиск продуцентов, выделение и характеристика открытых ферментов). Поэтому считаем уместным в обзоре уделить внимание и этим вопросам (в том числе и их методическим аспектам), что должно способствовать приобщению начинающих исследователей к актуальному направлению науки.
Ферментам рестрикции в клетке всегда сопутствуют идентичные по субстратной специфичности модифицирующие метилазы, защищающие внутриклеточную ДНК от действия сопряженной рестриктазы. Учитывая близкую функциональную взаимосвязанность ферментов рестрикции-модификации следовало бы их рассматривать совместно. Однако, метилтрансферазы этого типа подробно рассмотрены в обзоре, опубликованном в 23 томе серии «Молекулярная биология. Итоги науки и техники». [9]. В настоящей работе сведения об модифицирующих метила-зах, являющихся компонентами систем рестрикции-модификации, будут представлены только в той мере, в которой это будет необходимо для характеристики рестриктаз.
Часть I. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ II ТИПА
1. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ,
ИХ НОМЕНКЛАТУРА И КЛАССИФИКАЦИЯ
История открытия ферментов рестрикции, детальная характеристика их биологической роли, энзиматических и структурных особенностей детально рассмотрена в большом количестве обзоров [49, 58, 59, 62, 263, 309, 417]. Учитывая направленность настоящего обзора на рассмотрение одного из известных типов рестриктаз, в этом его разделе ограничимся лишь описанием некоторых общих вопросов, призванных в первую очередь определить место специфических эндонуклеаз (рестриктаз II типа) среди других обсуждаемых ферментов.
Открытие рестриктаз уходит корнями в исследование молекулярных основ феномена хозяйской специфичности, обнаруженного в начале пятидесятых годов, в ходе изучения эффективности посева фагов при смене хозяина [76, 234, 235]. Последующие исследования этого явления, выполненные в основном Арбером с сотр. [60, 61, 62, 126, 232], привели к
раскрытию состава и особенностей функционирования штаммоспецифической системы рестрикции и модификации ДНК. В эту систему входят два специфичных для определенного штамма фермента — ДНК модифицирующий (метилаза цитозиновых или адениновых остатков ДНК) и ДНК расщепляющий (эндодезок-сирибонуклеаза-рестриктаза). Эти ферменты узнают в ДНК идентичные короткие последовательности нуклеотидов. Метилаза, модифицируя определенные основания в пределах узнаваемого участка, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы. Проникшая в микробную клетку, обладающую системой хозяйской специфичности, немодифицированная соответствующим образом ДНК подвергается расщеплению внутриклеточной специфической эндонуклеазой. В подавляющем большинстве случаев это приводит к инактивации этой ДНК.
Первые рестрикционные эндонуклеазы были выделены в 1968 г. из штаммов Е. coli В и К [232, 266]. Оказалось, что системы рестрикции-модификации довольно цшроко распространены у бактерий. Из различных штаммов микроорганизмов были выделены ферменты рестрикции-модификации, различающиеся между собой по структурной организации, потребностям к кофакторам и особенностям субстратной специфичности.
Стремительный рост числа обнаруженных ферментов рестрикции и накопление данных об их структурных и функциональных особенностях вызвал необходимость ввести единую номенклатуру и классификацию этих энзимов.
Перед тем, как приступить к изложению вышеуказанных вопросов, следует отметить, что за прошедший период выделено
и идентифицировано особенно много специфических эндодезоксирибонуклеаз [319], для которых не исследовано ни их участие в феномене рестрикции, ни наличие в этих же клетках соответствующей по специфичности метилазы. Тем не менее, для обозначения этих нуклеаз по традиции используется название рестриктаз (рестрикционных эндонуклеаз).
