Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
4.4.7. Чувствительность метилаз к модификациям субстрата ... 62
4.5. Практическое применение сведений о различных проявлениях субстратной специфичности рестриктаз................................63
5. Физико-химические свойства рестрикционных эндонуклеаз ... 66
6. Ферментативные свойства рестриктаз..............................68
6.1. Каталитические свойства рестрикционных эндонуклеаз ... 69
6.1.1. Эффективные кинетические параметры...............................69'
6.1.2. Механизм реакции гидролиза кольцевых форм ДНК эндонуклеазами рестрикции ......................................70
6.1.3. Исследование процесса гидролиза линейных форм ДНК эндонуклеазами рестрикции....................................................74
6.1.4. Гидролиз синтетических олигонуклеотидов эндонуклеазами рестрикции .................................................................76-
6.1.5. Расщепление однонитевой ДНК эндонуклеазами рестрикции . 77
7. Взаимодействие рестриктаз II типа с модифицированными субстратами ....................................................................78
7.1. Роль отдельных групп атомов гетероциклических оснований участка узнавания ...................................................... 7&
7.1.1. Аденин...........................................................80
7.1.2. Тимин............................................................82
7.1.3. Цитозии..........................................................84
7.1.4. Гуанин...........................................................87
7.2. Влияние нуклеотидных последовательностей, фланкирующих участок узнавания ...........................................................88
7.3. Взаимодействие рестриктаз с углеводфосфатным остовом участка
узнавания..........................................................90
7.3.1. Фосфатные группы.................................................90
7.3.2. Углеводный остаток...............................................92
7.4. Некоторые аспекты взаимодействия рестриктаз с отдельным нуклеотидом (или его звеном) участка узнавания..............................94
8. Рентгеноструктурное исследование комплекса рестриктазы EcoR I
с субстратом.........................................................96
9. Молекулярная генетика ферментов рестрикции-модификации . . 100
ц. Структура генов рестрикции-модификации......................... 101
д.2 Регуляция экспрессии генов рестрикции-модификации . . . . 104
9.2.1. Структура регуляторных областей генов rm......................105
9.2.2. Возможные механизмы скоординированной экспрессии генов rm 107
g 3. Гомология генов, кодирующих ферменты рестрикции-модификации 114
Литература...........................................................116
Часть II. МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕСТРИКТАЗ ..................................................................126
1. Определение активности рестриктаз...............................126
2. Поиск продуцентов рестриктаз....................................130
2.1. Биологические подходы к поиску продуцентов рестриктаз . . 131
2.2. Биохимические методы поиска продуцентов специфических эндонуклеаз ...........................................................135
3. Очистка рестриктаз . . ...................................141
3.1. Получение бесклеточных экстрактов...............................144
3.2. Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз......................144
3.2.1. Нехроматографические методы...................................145
3.2.2. Хроматографические методы разделения нуклеиновых кислот и
рестриктаз.......................................................148
3.3. Методы, используемые для очистки рестриктаз.................154
3.4. Возможные перспективные направления развития препаративной
биохимии рестриктаз..............................................160
3.4.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография ... 160
3.4.2. Новые методические подходы к разработке схем очистки . . 161
3.5. Выделение гомогенных препаратов рестриктаз....................162
4. Определение субстратной специфичности рестриктаз . . . 170
4.1. Косвенные методы определения узнаваемого участка . . . 170
4.2. Методы определения места расщепления субстрата . . 173
5. Клонирование геиов рестрикции-модификации.......................180
5.1. Методические аспекты клонирования генов rm...................185
5.2. Факторы, влияющие на успешное клонирование генов rm . . 188
5.2.1. Скоординированная экспрессия..................................188
5.2.2. Ограничение модифицированной ДНК..............................191
5.3. Конструирование продуцентов рестриктаз и метилаз .... 193
Литература...........................................................195
