Биохимия клеточного цикла - Вольпе П.
Скачать (прямая ссылка):
К этому вопросу привели следующие соображения. По расчетам, в ядре эукариотической клетки, например клетки HeLa (см. рис. 1 и 2), содержится ДНК с общим молекулярным весом около 5000 млрд. Это примерно соответствует количеству ДНК в 5000 бактериальных клеток. Хромосомы клеток, в которых размещена вся эта ДНК, имеют сложнейшую организацию [50]. Кажется маловероятным, чтобы образующиеся 5-метилцитозины распределялись по всей длине цепей ДНК равномерно, без каких-либо вариаций по отдельным генам. Для того чтобы проверить это, нужны были тщательные исследования [39]. Вначале была сделана попытка фракционировать ДНК.
На рис. 15 представлены проведенные эксперименты по фракционированию ДНК из клеток HeLa в градиенте сульфата цезия с серебром [51]. В таком градиенте получили две фракции: одну небольшую, но более тяжелую, богатую гуанином и цитозином, и другую — большую и более легкую, богатую аденином и тимином. Обе фракции оказались метилированными. Пунктирная кривая на рис. 15 соответствует распределению 5-метилцитозинов в этих двух фракциях. Каждую из фракций ДНК гибридизировали с рибосомальной РНК, и оказалось, что эта РНК комплементарна более тяжелой фракции (этого и ожидали, исходя из более высокого содержания в ней Г и Ц). Таким образом, была выделена фракция ДНК, обогащенная генами рибосомальной РНК [52]. Эти данные были подтверждены в других лабораториях [53, 54].
Возвращаясь к распределению 5-метилцитозина в фракциях ДНК (рис. 15), отметим, что повышенный уровень метилирования в пике с большим содержанием гуанина и цитозина (с учетом статистического разброса) не вызывает удивления: понятно, что, чем больше в цепи
Номера фракций
Рис. 15. Дифференциальное метилирование двух классов ядерной ДНК в клетках HeLa [51]. В градиенте Cs2S04—Ag+ получали два пика ДНК: более «тяжелый», с сильно метилированным левым плечом, и более «легкий», с сильно метилированным правым плечом. Сплошной линией показана оптическая плотность (ОП) ДНК, пунктирной линией — радиоактивность ДНК, соответствующая распределению 5-метилцитозина.
ДНК цитозина, тем больше вероятность ее метилирования.
Неожиданным оказалось другое — достаточно высокий уровень метилирования цепей ДНК, богатых адени-ном и тимином, в менее плотной фракции. Значит, в этой фракции относительный уровень метилирования не мог объясняться величиной «мишени». Действительно, в то время как мишень по мере обогащения нитей ДНК парами АТ уменьшалась, метилирование увеличивалось.
Это явно указывает на то, что в данном случае метилирование некоторых участков цепи, возможно, не объясняется просто распределением пар ГЦ [52]. С другой стороны, можно было предположить, что существуют два субстрата для метилирования — обогащенный ГЦ (возможно, типа ...ГЦГ...) и обогащенный АТ (возможно, типа ...ГЦА...)—и что должны существовать также два разных типа ДНК-метилаз [1, 52].
13. Не происходит ли избирательного метилирования повторяющихся последовательностей регуляторных генов!
На рис. 16 представлены результаты опытов, показывающих, что в ДНК более интенсивно метилируются повторяющиеся последовательности транскриптона (транскрипционной единицы), т. е. гены-регуляторы [39].
ДНК, сильно метилированную в середине фазы S клеточного цикла (см. рис. 13 и 14), подвергали очистке в градиенте CsCl [35]. После соответствующей обработки [39] эту ДНК гибридизировали с гигантской РНК, выделенной из ядер (пре-мРНК) [55].
Полученные гибриды содержали 5-метилцитозин (рис. 16, Б). Но когда ту же метилированную ДНК гибридизировали с мРНК, выделенной из полисом (мРНК короче пре-мРНК, являющейся ее предшественником [55, 56]), в гибридах уже не было 5-метилцитозина (рис. 16, В). Эти результаты ясно показали, что метилирование, видимо, происходит главным образом в регуляторных генах (в регуляторной зоне транскриптона [55]), но не в структурных генах (в уникальной зоне транскриптона [55]).
Этот вывод был еще одним шагом вперед в изучении метилирования ДНК [39]. Как мы увидим, это имело решающее значение не только для понимания структурной модификации ДНК как таковой, но и для поисков места специфического взаимодействия между геномом онкогенного вируса и геномом клетки [39].
Подводя итоги, можно сказать следующее: ядерная
ДНК реплицируется в фазе S и репарируется в осталь-
Рис. 16. Преимущественное метилирование повторяющихся участков в транскриптоне [39]. А. Седиментация в градиенте CsCl метилированной ядерной ДНК, выделенной в середине фазы S (радиоактивность 5-ме-тилцитозина сдвинута в сторону ДНК с большей плотностью). Б. Гибриды между метилированной ядерной ДНК, выделенной из фракций градиента, и пре-мРНК» комплементарной ко всему транскриптону, содержат 5-метилцитозин. В. Гибриды между теми же фракциями ДНК и мРНК, выделенной из полисом, т. е. комплементарной к уникальному участку транскриптона, почти не содержат 5-метилцитозина. Черные точки — оптическая плотность ДНК; черные кружки — радиоактивность иС 5-метилцитозина ДНК; светлые кружки — радиоактивность 3Н гибридной РНК.
