Биохимия клеточного цикла - Вольпе П.
Скачать (прямая ссылка):
Уже давно подготавливался эксперимент, который мог бы дать ясный ответ на этот вопрос. Он был основан на идее использования одного меченого предшественника, позволяющего сразу получить сведения как о репликации ДНК, так и о ее метилировании [45].
На рис. 12 представлена схема опыта [39].
Метионин имеет метальную группу и после превращения в S-аденозилметионин способен метилировать ДНК [46]. Этот процесс происходит в ядре. Кроме того, углерод метальной группы после ряда окислительных реакций может войти в пуриновое кольцо и таким образом включиться в основной скелет молекулы аденина или гуанина; аденин и гуанин в свою очередь превращаются в нуклеозиды, а затем в их ди- и трифосфаты (дАТФ и дЦТФ); эти нуклеозидтрифосфаты служат предшественниками в синтезе ДНК.
Углерод метальной группы метионина не может, однако, войти в пиримидиновое кольцо, так что в цитозин он не включается. Тем не менее эта группа может соединяться с пиримидиновым кольцом урацила. В этом случае в растворимом пуле урацил превращается в тимин, присоединяя группу — СН3 в положении 5. Эта СН3-груп-па содержит углерод, происходящий из метильной группы метионина. Образовавшийся тимин превращается в нуклеозидтрифосфат дТТФ, который в свою очередь
2—356
Часы клеточного цикла
Рис. 13. Корреляция между синтезом и метилированием ядернойДНК в течение митотического цикла клеток HeLa [47]. Оба процесса прослежены по данным об удельной радиоактивности оснований в гидролизате ДНК из клеток, инкубированных с (14С-метил)-метионином (при 60-минутных периодах включения метки с часовыми интервалами на протяжении всего цикла). 1 — аденин; 2 — тимин; 3 — гуанин; 4 — 5-метилцитозин.
участвует вместе с дАТФ и дЦТФ в синтезе ДНК. Эти процессы происходят в цитоплазме.
Исходя из этого, предположили, что, используя общий меченый предшественник— (14С-метил)-метионин,— можно параллельно или раздельно (проводя опыты на целых клетках или на изолированных ядрах) проследить метилирование ДНК (при участии ДНК-метилазы) и синтез ДНК (при участии ДНК-зависимой ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы) [45].
Часы клеточного цикла
Рис. 14. Метилирование ДНК в изолированных ядрах [47]. О процессе судили по удельной радиоактивности 5-метилцитозина в гидролизате ДНК, выделенной из изолированных ядер после инкубации их с (14С-метил) -метионином или с S-аденозил-(14С-метил)-метионином (при 60-минутных периодах включения с часовыми интервалами на протяжении всего цикла). Светлые кружки — 5-метилцитозин; черные кружки — аденин; квадратики — гуанин; треугольники — тимин.
Были проведены две серии экспериментов (рис. 13 и 14).
В первой серии целые клетки метили (14С-метил)-метионином в течение 30 мин с интервалами 1 ч. После каждого 30-минутного периода из клеток экстрагировали
2*
ДНК, очищали ее, гидролизовали до оснований и проводили хроматографию [47J. В элюированных с бумаги пятнах определяли радиоактивность, соответствующую 14С-метионину. Аденин, гуанин, тимин и 5-метилцитозин обнаруживали большую радиоактивность в фазе S клеточного цикла. Цитозин не метился. Метилирование ДНК, прослеженное по метке 5-метилцитозина, проходило параллельно с синтезом ДНК, о котором судили по включению метки в аденин, гуанин и тимин (рис. 13). Метка в этих трех основаниях в сопоставлении с меткой в 5-метилцитозине служила, таким образом, надежным «внутренним» контролем при установлении корреляции между синтезом и метилированием ДНК.
Во второй серии опытов с (14С-метил)-метионином (или, лучше, с радиоактивным S-аденозилметионином) инкубировали не целые клетки, а только изолированные ядра, в которых, как известно, синтез ДНК не происходит из-за отсутствия пула нуклеозидтрифосфатов [48]. В этих условиях путь синтеза ДНК был «хирургически» исключен [47]. В изолированных ядрах метилирование ДНК, прослеженное по включению метки в 5-метилцитозин, оставалось в фазе S таким же, как и в первой серии опытов, а радиоактивность аденина, гуанина и тими-на, которая указывала бы на синтез ДНК, полностью отсутствовала (рис. 14). Таким образом, метилирование ДНК в фазе S клеточного цикла всегда происходило и в отсутствие синтеза ДНК.
Эти результаты весьма существенны. Стало ясно, что в изолированных ядрах, где не могут работать ДНК-поли-мераза и ДНК-лигаза, синтезирующие новую ДНК, ДНК-метилаза продолжает действовать, образуя 5-метилцитозин в ДНК-полимере [47].
Кроме того, из этих экспериментов следовал неожиданный и важный вывод: если в изолированных ядрах не могут синтезироваться новые цепи ДНК, то, значит, метилирование, наблюдаемое в фазе S (рис. 14), происходит только в старых цепях ДНК, т. е. в тех, которые дочерние клетки унаследовали от материнской клетки. Эти результаты, подтвержденные другими исследованиями [49], явились важным этапом в изучении метилирования ДНК в изолированных ядрах [39]..
12. Метилирование ДНК — процесс неравномерный и дифференцированный
После того как было установлено, что «старые» цепи ДНК метилируются в фазе S клеточного цикла, возник вопрос, равномерно или неравномерно происходит такое метилирование [39].
