Биофизика - Владимиров Ю.А.
Скачать (прямая ссылка):
изучения изменений структуры мембран в патологии, а также под действием
лекарств и других биологически активных соединений.
Вращательная диффузия более крупных зондов, например зонда б, который
представляет собой производное холестерина, заторможена в липидном слое
довольно силь-но, отчего спектры таких зондов сильно изменены по
сравнению со спектром зонда а (см. рис. 46). Теория метода ЭПР дает
формулы, по которым можно на основании таких параметров спектра, как
относительная величина максимумов и расстояние между ними, рассчитать
время т, затрачиваемое в среднем на поворот молекулы на один радиан; это
время прямо пропорционально микровязкости мембраны. Этим методом была
измерена микровязкость липидного слоя в мембранах эритроцитов, нервных
волокон, митохондрий, саркоплазматического ретикулума и др. Она оказалась
равной 30-100 мПа • с, т. е. близкой к вязкости подсолнечного масла
(напомним, что вязкость воды равна примерно 1 мПа • с). Так, было
установлено, что липидный бислой по своей консистенции -жидкость, в
которой легко происходит диффузия молекул. Как уже говорилось,
микровязкость мембран изменяется при многих видах патологии, а также при
действии на мембраны биологически активных соединений. С этим связывают
117
надежды применения метода спиновых зондов в клинической диагностике и при
создании новых лекарственных средств.
В последнее время в биофизических исследованиях широко используются
спинмеченные жирные кислоты и синтезированные на их основе фосфолипиды
(например, зонд в на рис. 46). Молекулы этих соединений встраиваются в
липидный бислой наравне с молекулами составляющих его фосфолипидов;
подвижность метки характеризует поэтому подвижность соответствующего
участка "средней" фосфолипидной молекулы в данном бислое. Можно
синтезировать метки, прикрепленные к разным участкам углеводородной цепи
или к полярной "головке" фосфолипида, и тогда по форме сигнала ЭПР
оценивать подвижность соответствующих частей фосфолипидной молекулы.
Одной из количественных характеристик подвижности при этом может служить
так называемый параметр упорядоченности (,S), который показывает, во
сколько раз вращение молекулы вокруг ее продольной оси (которая
приблизительно перпендикулярна плоскости мембраны) быстрее вращения
спинмеченного участка молекулы вокруг оси, лежащей в плоскости мембраны.
Для плотно упакованных бислоев S велико, а при снижении вязкости мембран
S уменьшается, поскольку углеводородные цепи получают возможность не
только вращаться вместе со всей молекулой вокруг ее длинной оси, но и
скручиваться. Использование зондов с различным положением спиновой метки
позволило показать, что подвижность жирнокислотных цепей- возрастает
ближе к концу цепи, т. е. к центру липидного бислоя.
Основной недостаток метода флюоресцентных и спиновых зондов заключается в
том, что хотя эти молекулы и невелики, все же, включаясь в липидный
бислой, они несколько изменяют его свойства. Этого недостатка практически
лишен более дорогой и сложный метод ЯМР.
Метод ЯМР основан на наличии у многих ядер (44, 2Н, 13С, 14N, 170, 31Р,
33S и др.) собственного магнитного момента. Наибольшее распространение в
настоящее время имеет метод измерения сигналов от ядер водорода
(протонов) в органических молекулах. Если бы протон был совершенно
изолирован, он давал бы одну узкую линию в спектре ЯМР. Но в органических
молекулах протон оказывается в магнитном поле, которое складывается из
приложенного к образцу внешнего магнитного поля и из локального
магнитного поля, сформированного движением элек-
118
0%xc
Рис. 47. Спектры ЯМР водной суспензии липосом из фосфатидилхолина с
различным содержанием холестерина (Филипс, 1969].
У спектров указано содержание холестерина в молярных процентах. Цифры у
кривых показывают снижение амплитуды максимумов поглощения в процентах к
контролю из-за ограничения подвижности соответствующих групп
холестерином; 1 ООО ООО Av/v - химический сдвиг.
тронов по орбиталям внутри молекулы. Суперпозиция внешнего и внутреннего
магнитных полей приводит к тому, что положение линии протона в спектре
ЯМР сдвигается на ту или иную величину в зависимости от химического
строения той группы, в окружении которой этот протон находится. Величина
такого химического сдвига выражается обычно в так называемых миллионных
долях о = I 000 000 Av/v, где Av - сдвиг частоты по отношению к частоте
поглощения v стандартного образца.
На рис. 47 приведен спектр ЯМР суспензии липосом, приготовленных из
яичного фосфатидилхолина. Хорошо видны три полосы поглощения,
обусловленные протонами Ы(СНз)з-групп холина, СН2-групп жирных кислот и
их концевых СНз-групп.
Ценность метода ЯМР при изучении биологических мембран заключается не
столько в том, что по спектрам ЯМР можно сказать, сколько тех или иных
групп содержит образец (содержание их пропорционально площади
соответствующих. пиков), сколько в том, что ширина полос позволяет судить
