Биофизика - Владимиров Ю.А.
Скачать (прямая ссылка):
вязкостью имеется обратная зависимость:
-2-г= , причем ka --- , (5.12)
ft°c0 Ч I(tm)
где г) о - вязкость стандартного раствора, т] - микровязкость липидов в
мембранах, с0 и с - концентрация зонда в стандартном растворе и в
мембране, kl и k9 - коэффи-
113
Рис. 44. Изменение спектров флюоресценции пирена в зависимости от
микровязкости окружения.
1 - спектр в мембранах без холестерина; 2 - спектр в мембранах,
содержащих много холестерина; 1м, 1э - интенсивность флюоресценции
мономеров и эксимеров пирена (соответственно).
•Wr/r)
Рис. 45. Зависимость микровязкости липидной фазы р-ли-попротеидов плазмы
крови человека от содержания в них холестерина.
Кружочками обозначены липопротеиды низкой плотности, треугольниками -
очень низкой плотности; шхс, гпл - массы холестерина н липидов в 0-
липопротеидах; 1М. 10 - интенсивность
флюоресценции мономеров и эксимеров пнрена (соответственно) (см. рис.
44).
циенты эксимеризации, /э и /м - интенсивность флюоресценции в максимумах
эксимера и мономера (см. рис. 44).
Используя флюоресцентные зонды, можно изучать микровязкость не только
мембран, но и липидов в липопро-теидах плазмы крови. При повышенном
содержании холестерина в плазме крови микровязкость липопротеидов
увеличивается (рис. 45). Это приводит к ряду нарушений метаболизма
липидов плазмы, которые характерны для болезней сердечно-сосудистой
системы, связанных с ги-перхолестеринемией.
5.4. ИЗМЕРЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ ЛИПИДНЫХ МОЛЕКУЛ
В МЕМБРАНАХ МЕТОДАМИ РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ
Изучение подвижности жирнокислотных цепей фосфолипидов и самих липидных
молекул в биологических мембранах осуществляется в настоящее время
главным образом методами радиоспектроскопии: электронного парамагнитного
резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В первом из этих
методов измеряют сигналы ЭГ1Р, даваемые спиновыми метками и спиновыми
зондами. Основу спиновых меток и зондов составляет стабильный свободный
иминоксилъный радикал, имеющий такую структуру:
где Rx и R2 - различные химические группировки.
Если производное иминоксильного радикала присоединяют к белку или липиду
ковалентной связью, то такое производное называется спиновой меткой. Если
молекула (например, спинмеченный фосфолипид или спинмеченный холестерин)
встраивается в белковую молекулу или в липидный бислой мембран и там
удерживается не ковалентными связями, а с помощью электростатических сил
или гидрофобных взаимодействий, то такая молекула называется спиновым
зондом. Форма сигнала ЭПР, даваемого спиновой меткой или зондом, зависит
от микроокружения иминоксильного радикала и в первую очередь от
вращатель-
115
о=<, >=0
/1^//////////////////////////У///////////////,° ° 7////////////////
П "
| ге
/V
"I
о
CQ
32^6 3240 3266 Пй, Гс "-Т
м
2А"
2Аа'
Ад-Д|
т=в,73-Ю *А Но[(.0/. S= -д^
.1,723
Рис. 46. Метод спиновых зоидов при изучении биологических мембран.
в-в - формулы некоторых спиновых зондов; г - сигнал ЭПР зонда (а) в
суспензии мембран (отиошеиие f-afh характеризует распределение зоида
между липидной и водной фазами); д -сигнал ЭПР зонда (б) (т - время
корреляции); е-сигнал зоида (в) (величина 2АП характеризует подвижность
углеводородных "хвостов" в мембране: она уменьшается с увеличением
подвижности); S -параметр упорядоченности.
ной подвижности той группы (или молекулы в целом), в состав которой он
входит. В среде с низкой вязкостью небольшие молекулы спиновых зондов,
например зонд, изображенный на рис. 46, а, дают сигнал ЭПР. Этот сигнал
состоит из трех узких полос, так как неспаренный электрон находится в
магнитном поле, на которое накладывается магнитное поле ядра азота,
обладающего спиновым числом, равным 1. Теория ЭПР и прямые эксперименты
показывают, что, если вращение зонда заторможено, сигнал расплывается
(рис. 46, е).
Метод спиновых зондов имеет множество модификаций. Рассмотрим, например,
применение зондов, изображенных
на рис. 46. Зонд (а) имеет небольшие размеры, поэтому скорость его
вращательной диффузии достаточно велика не только в водном растворе, но и
в липидной фазе мембраны; спектр ЭПР этого зонда в обоих случаях состоит
из трех узких линий. Однако положение третьего максимума сигнала
(соответствующего наибольшей напряженности магнитного поля) различно для
зонда, растворенного в воде, и зонда, включенного в мембрану. Амплитуда а
на рис. 46, г пропорциональна содержанию зонда в мембране, а амплитуда b
- содержанию зонда в воде. Величина / = а/(а + b) = a/h (рис. 46, г)
показывает, какая часть всего зонда в системе находится в связанном с
мембраной состоянии и носит название параметра солюбилизации, f для
липидных мембран в жидком состоянии в 6-7 раз выше, чем в твердом. На
этом основано использование этой величины для определения m-Jmr при
изучении фазовых переходов в липидном слое мембран. В биологических
мембранах даже небольшие изменения в структуре липидного бислоя обычно
отражаются на величине /, поэтому ее измерение широко используют для
