Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
в них добавляют культуральную среду с 10—20 % сыворотки и инкубируют при 37 °С.
1.4. Слияние клеток вирусом Сендай в суспензии: 1) клетки А и Б культивируют в монослое, обрабатывают трипсином и снимают с культуральных флаконов средой, содержащей 10 % сыворотки (присутствие сыворотки необходимо для предотвращения образования клеточных комков при снятии); 2) клетки А и Б по отдельности центрифугируют 5 мин при 700 g, сливают супернатанты, ресуспензи-руют в 1 —10 мл (в зависимости от массы осадка) раствора Хэнкса, подсчитывают количество клеток в камере Горяева; 3) смешивают клетки А и Б; если клетки имеют одинаковые размеры и одинаковую способность к прикреплению, то их численное соотношение должно быть примерно равно 1; в остальных случаях следует брать избыток более мелких и хуже прикрепляющихся клеток (см. метод 1.3, п. 5); доводят объем смешанной суспензии клеток до 50—100 мл раствором Хэнкса, центрифугируют 5 мин при 4 °С и 700 g; 4) сливают супернатант, ресуспензируют клетки в холодном растворе, содержащем инактивированный вирус Сендай (содержание клеток в жидкости должно составлять 2—5 млн./мл), переносят суспензию в пробирку емкостью 10 мл, инкубируют 30 мин при 4 °С; 5) добавляют в пробирку нагретую до 37 °С культуральную среду без сыворотки в объеме, равном объему суспензии клеток, переносят пробирку в водяную баню и инкубируют 45 мин при 37 °С; 6) переносят суспензию в пробирку емкостью 100 мл, разводят в 10 раз теплым раствором Хэнкса, центрифугируют 5 мин при 700 g и комнатной температуре;
7) сливают супернатант, ресуспензируют клетки в теплой культуральной среде* с 10—20 % сыворотки (содержание клеток в среде должно составлять 150—200 тыс./мл в пересчете на наиболее крупные и хорошо прикрепляющиеся клетки-партнеры), переносят суспензию клеток в культуральную посуду и инкубируют при 37 °С.
2.1. Слияние клеток с помощью ПЭГ в монослое [11] : 1) клетки А и Б (по 100 тыс./мл) в 2 мл культуральной среды с 10 % сыворотки высаживают на покровные стекла, находящиеся в пенициллиновых флаконах, и инкубируют 4 ч при 37 °С; 2) приготовляют 8 мл 50 %-ного раствора ПЭГ с молекулярной массой 1000—6000; для этого 4 г ПЭГ переносят в закрытую ватно-марлевой пробкой пробирку и нагревают в кипящей водяной бане в течение 1 ч (стерилизация ПЭГ); в случае, если гибридные клетки должны будут расти более 1 нед, навеску ПЭГ автоклавируют 1 ч при 1 атм (к расплавленному ПЭГ прибавляют 4 мл культуральной среды без сыворотки и перемешивают, pH ПЭГ доводят до 7.8—8.0 примерно 0.05 мл 1 н. NaOH, затем pH 50 %-ного раствора ПЭГ проверяют по индикаторной бумаге Lachema, ЧССР, или Whatman, США); 3) к поверхности проточной металлической кюветы с ячейками с помощью пластилина прикрепляют, вырезанный из пластиковой 24-ячеечной платы ТС24 производства «Flow» (Великобритания) 4-ячеечный блок (один ряд), который предварительно стерилизуют, выдерживая 1 ч в 70 %-ном спирте и 2—3 ч под УФ-светом на расстоянии 15 см от лампы БУВ-30-2; металлическая кювета присоединена к ультра-
термостату, отрегулированному на 41 °С (при этом температура воды в ячейках кюветы равна 38—39 °С); в одну из ячеек кюветы, наполненную водой, помещается пробирка или стаканчик емкостью 25— 100 мл с культуральной средой, остальные ячейки содержат небольшое количество воды — здесь будут стоять во время слияния флаконы с клетками; 4) одну из пластиковых ячеек блока заполняют 50 %-ным раствором ПЭГ, в соседней пластиковой ячейке приготовляют 25 %-ный раствор (культуральной средой вдвое разводят 50 %-ный раствор); 5) флаконы с клетками переносят в ячейки проточной кюветы и глазным пинцетом извлекают покровное стекло с клетками; стекло промывают в теплой культуральной среде, дают среде стечь и переносят стекло на 1 с в пластиковую ячейку с 50 %-ным раствором ПЭГ, затем — на 1 с в 25 %-ный раствор ПЭГ и далее промывают в культуральной среде. Переносы «среда -> -> 50 %-ный ПЭГ -> 25 %-ный ПЭГ -> среда» повторяют 5—10 раз; затем стекло с клетками возвращают во флакон с полной культуральной средой, который во время переносов находился в ячейке проточной кюветы при 37 °С. По окончании слияния все флаконы с клетками переставляют в термостат при 37 °С.
2.2. Слияние клеток с помощью ПЭГ в суспензии. Слияние проводят в водяной бане при 37 °С — используют заполненные водой ячейки проточной кюветы ультратермостата (о численном соотношении клеток А и Б при слиянии см. метод 1.4, п. 3 и 1.3, п. 5). Следует заметить, что в суспензии с помощью ПЭГ сливают лимфоциты селезенки и клетки миеломы при получении гибридом. Соотношение лимфоцитов и клеток миеломы от 5 : 1 до 10 : 1. При слиянии с помощью ПЭГ в суспензии в общей сложности берут несколько десятков или сотен миллионов клеток: 1) суспензии клеток А и Б смешивают в нужном соотношении и центрифугируют 5 мин при 700 g; 2) надосадочную жидкость тщательно отсасывают пипеткой, добавляют в пробирку по каплям 1 мл 50 %-ного теплого раствора ПЭГ (о приготовлении этого раствора см. метод 2.1, п. 2); ресуспензи-рование осадка следует проводить мягко с помощью пипетки емкостью 5 или 10 мл, имеющей достаточно широкое выходное отверстие;
