Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Истинная распространенность микоплазменной контаминации клеточных культур может быть еще выше, чем это публикуется, причем в тех случаях, когда контаминацию игнорируют, она не исчезает сама собой, но распространяется на другие культуры. Мико-плазменная инфекция не сопровождается видимыми изменениями клеток, и в этом случае без специального анализа, как правило, остается незамеченной исследователем. Однако эта же инфекция иногда переходит в острую форму, и тогда до 25 % общего белка в культуре клеток и до 15 % ДНК может быть микоплазменного происхождения [18]. В этом смысле неудивительно, что микоплазмы существенно влияют на метаболизм клетки-хозяина, вызывая изменения аминокислотного, углеводного и нуклеинового обмена [19—22]. В ранних работах обсуждается способность микоплазм вызывать хромосомные абберации клеток млекопитающих [23] и даже неопластические эффекты [24—26].
Бактериальной контаминации клеточных культур уделяется в настоящее время не столь большое внимание, поскольку инфицированные бактериями культуры достаточно хорошо определяются макроскопически и могут быть легко выбракованы. При рутинном контроле бактериальная контаминация обнаруживается также посевом культуральной среды или смеси культуральной среды с клетками на жидкие и твердые бактериологические питательные среды. Тем ие менее описаны случаи инфицирования клеток некоторыми видами бактерий, которые не вызывают ни помутнения культуральной среды, и ни ярко выраженных цитодеструктивных изменений клеточного монослоя. Среди них были выявлены коринбактерии, микрококки их бациллы [27].
Определить источник контаминации в большинстве случаев бы-4 вает чрезвычайно трудно. Известно, что иногда контаминация яв-к5
ляется прямым следствием использования инфицированного субстрата. Кроме того, источником контаминации могут явиться компоненты питательных сред, прежде всего сыворотки крупного рогатого скота, лошади, свиньи, а также трипсин и другие компоненты/ Реальным и достаточно распространенным источником контаминации является внутрилабораторная передача инфекции из воздуха, от персонала, от используемых лабораторных препаратов и от одной культуры клеток к другим. Известно, что совместное культивирование в одном помещении контаминированных и свободных от микоплазмы клеток уже через 1—2 пассажа приводит к инфици-рованию последних.
Очевидным является тот факт, что формы контаминации многообразны. Ясно, что залогом получения линий клеток, не содержащих посторонних агентов, является проведение контрольных испытаний. Немаловажную роль в получении чистых клеточных линий играет система организации банков клеток. По требованиям ВОЗ [28] клеточный банк закладывается из размноженных путем серийного субкультивирования клеток до выбранного уровня пассажей, на котором они смешиваются для составления одного пула и хранятся при низких температурах (—70 °С или ниже) в виде кратных частей.
Предварительная характеристика таких банков по основным параметрам, включая их безопасность, является основным условием получения сравнимых результатов при работе с клеточными культурами.
В упомянутой серии технических докладов ВОЗ определены требования к диплоидным и перевиваемым линиям клеток, используемым в производственных целях. Однако в этих материалах нет подробного описания методов проведения контрольных испытаний.
В данном разделе книги обобщен опыт отечественных и зарубежных исследователей по контролю клеточных культур на отсутствие посторонних агентов.
Методы выявления посторонних вирусов
в клеточных культурах и сыворотке
Контролю подвергается клеточная суспензия в концентрации, обычно используемой для посева. Клетки выращиваются при 37 °С во флаконах, удобных для выполнения контрольных испытаний. За культурами наблюдают не менее 14 сут, обследуя на наличие цитопатических изменений. В конце срока наблюдения по неспецифическим случайным причинам может быть исключено не более 20 % клеточных культур.
За время культивирования клеток не должно наблюдаться признаков дегенерации, вызванной вирусами. По истечении срока инкубации из всех испытуемых флаконов отбирают пробы культуральной жидкости, объединяют и исследуют на клеточных культурах, лабораторных животных и куриных эмбрионах.
В некоторых странах перевиваемые клетки проходят испытания на присутствие ретровирусов: используется специальные тесты на наличие обратной транскриптазы, а также электронно-микроскопн-ческие методы.
Контроль на клеточных культурах. Контролю подлежат испытуемые клетки, инкубированные в течение 14 сут, которые исследуются на наличие гемадсорбирующих, цитопатогенных и гемагглютинирую-щих агентов. С этой целью культуральную жидкость из тестируемых флаконов сливают, клеточный монослой отмывают раствором Хэнкса или 0.85 %-ным раствором NaCl при температуре 20—25 °С и во флаконы вносят 0.25 %-ную взвесь эритроцитов морской свинки в том же растворе так, чтобы покрыть весь клеточный монослой. После инкубации при 0—4 °С, а затем в течение 30 мин при 20—25 °С взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хэнкса при 20—25 °С и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции. В некоторых странах национальные контрольные органы рекомендуют проводить испытания на гемадсорби-рующие агенты также и с эритроцитами человека (группа крови 0), обезьян, кур или каких-либо других птиц. Результаты реакции регистрируются так же как в случае применения эритроцитов морской свинки. Исключение составляет реакция с эритроцитами обезьян, когда результат реакции регистрируют также после еще одной дополнительной инкубации в течение 30 мин при 37°С±1 °С.
