Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Среда Искова [15, 16] обозначается IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium) и предназначена для бессывороточного культивирования (в присутствии альбумина, трансферрина и липидов) лимфоцитов и кроветворных клеток. Используется также в случае постоянных линий клеток крови и гибридом. Исков дополнил наиболее богатый вариант среды Дульбекко заменимыми аминокислотами, биотином, витамином В12 и селенитом натрия. Селен необходим большинству клеток, он является компонентом ферментной системы,
разрушающей образующиеся в среде перекиси. В IMDM введен HEPES с параллельным уменьшением концентрации NaCl и NaHC03.. Осмоляльность исходного варианта DME (350 мосмоль/кг) находится на верхнем пределе для мышиных лимфоцитов (оптимальная — 280 мосмоль/кг). Обычно в момент приготовления к среде добавляется сульфгидрильное соединение 2-меркаптоэтанол (5 • 10-5 М) или а-тиоглицерин (7.5 • 10~5М).
Качественно близка по составу к IMDM среда аМЕМ; она использовалась для культивирования в присутствии сыворотки сначала клеток почки хомячка, а затем и других плохо растущих клеток. В некоторых случаях при нехватке в среде фолиевой кислоты или неспособности клеток ее использовать появляется необходимость введения в среду источника пуринов (обычно аденина или гипоксантина) и тимидина. Производятся два варианта аМЕМ — с рибо-и дезоксирибонуклеозидами или без них.
Среда Мак-Коя 5А и серия сред RPMI. Среда Мак-Коя 5А [17] была разработана в 1958 г. для поддержания клонального роста клеток карциносаркомы Уолкера 256 в присутствии сыворотки, а затем с успехом использована для первичных культур и различных клеточных линий, включая WI-38, ВНК/С13, ЗТЗ и др. Среда Мак-Коя 5А производится обычно в модификации Иваката и Грейса. В этом случае она идентична среде RPMI-1629 из серии сред RPMI (Roswell Park Memorial Institute), предназначенных для культивирования лейкоцитов в присутствии сыворотки. Относящаяся к этой серии среда RPMI-1640 [18] является в настоящее время одной из наиболее распространенных и применяется, в частности, при культивировании гибридом. В ряде случаев в средах на ее основе получали бессыворо-точный рост клеток. Как видно из табл. 2, обе эти среды содержат незаменимые и заменимые аминокислоты, незаменимые витамины, включая В12, парааминобензойную кислоту и глютатион, а также в относительно высокой концентрации глюкозу и особенно инозит. Для культивирования клеток в этих средах требуется 5 % СОг в атмосфере. Состав среды RPMI-1640 качественно проще. Принципиальным является то, что она содержит значительно меньше магния и особенно кальция и поэтому может использоваться как для моно-слойного, так и для суспензионного культивирования.
Среда Лейбовитца L-15. Из питательных сред, культивирование в которых можно проводить в условиях свободного газообмена с атмосферой, чаще всего используется среда Лейбовитца L-15 [6], разработанная для повышения безопасности, удобства и экономичности при проведении массовых вирусологических исследований. Для уменьшения закисления среды в процессе культивирования клеток в плотно закрытых сосудах глюкоза в качестве источника энергии заменена на D ( + )-галактозу и пируват. С другой стороны, защелачивание, свойственное открытым бикарбонатным системам, устранено заменой бикарбоната в качестве буфера на основные аминокислоты в высокой концентрации (pH среды 7.6). Чтобы избежать быстрого истощения среды, концентрация всех аминокислот увеличена до максимального, но не токсичного значения. В резуль-
тате быстро размножающиеся клетки (HeLa или НЕр2, например) требуют смены среды L-15 не чаще раза в неделю, а медленно размножающиеся (WI-38, первичные культуры) — не чаще раза в месяц.
Среды Хэма. С использованием жесткого критерия отбора — размножение одиночных клеток (клональный рост) — разработан метод оптимизации состава питательных сред, позволяющий минимизировать количество компонентов неопределенного состава [12]. Так были созданы широко используемые F-10 [19] и ее модификация F-12 [20], а также набор сред MCDB, где каждый состав
«подогнан» к определенному типу клеток [21]. Клетки яичников китайского хомячка клонируются в F-10, которую достаточно дополнить либо минимальным количеством сыворотки (2 %), либо фетуи-ном и альбумином (белка менее 100 мкг/мл), и в F-12, в которую введен селенит. Эти среды применяются также в случае культивирования плохо растущих клеток, в том числе первичных культур дифференцированных клеток разных видов. F-12 в смеси с DME является основой ряда бессывороточных сред.
Среды F-10 и F-12 содержат все описанные выше незаменимые компоненты, включая микроэлементы Fe, Zn, Си, а также заменимые аминокислоты, пируват, предшественники нуклеиновых кислот и липоевую кислоту. F-12 отличается наличием линолевой кислоты и путрисцина. Ненасыщенные жирные кислоты, к которым относится линолевая, незаменимы при бессывороточном культивировании, хотя клетки многих адаптированных постоянных линий могут размножаться без них. В коммерческих препаратах F-12 линолевая кислота часто находится в неактивной форме, так как легко окисляется; в таких случаях ее надо добавить. Избыток жирных кислот токсичен, поэтому их часто вводят в комплексе с сывороточным альбумином. Путрисцин или другие полиамины необходимы клеткам СНО и способствуют размножению клеток других типов. Высокая концентрация цинка в F-12, оптимальная для СНО, токсична для некоторых других клеток.
