Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Примечание. * — проницаемость в см3 02/1000 см2 при толщине пленки 25 мкм, ** — приводятся данные для необработанной поверхности; поверхностное натяженне воды — 720 мкН/см. *** — после автоклавирования уменьшается механическая прочность.
440 мкН/см. На необработанных чашках имеется некоторое количество отрицательных зарядов (может быть, это остатки карбоксильных групп после полимеризации). В лабораторных исследованиях применяются различные обработки. Так, ионы марганца в простом солевом растворе будут стимулировать как адгезию, так и распластывание клеток [17]. Возможно покрытие поверхности изделий различными полимерами: polyHEMA (поли-2-гидроксиэтилметакрилатом) [18, 19]; полиионинами (поличетвертичные полимерные амины) [20]; белковыми молекулами (коллагеном [21]; экстраклеточными комплексами, синтезируемыми эндотелиальными клетками человека [22]); полимерами полилизина, полиглютаминовой кислоты [23, 24];
положительно заряженными полимерами (годится практически любой такой полимер) [23).
Очень популярным является использование поли-О-лизина [23). Нужно приготовить в дистиллированной воде раствор поли-О-лизина (молекулярная масса 30 000—70 000) в концентрации 0.1 мг/мл, простерилизовать через мембранный фильтр. Затем налить 0.5 мл этого раствора на чашку Петри диаметром 60 мм. Равномерно распределить жидкость, наклоняя чашку. Через 5 мин раствор слить и чашку прополоскать 1.5 мл стерильной воды, тщательно удалив весь раствор, так как свободный полилизин при добавлении прямо в культуральную среду может ингибировать рост клеток. Чашки, обработанные таким образом, можно использовать сразу или после некоторого срока хранения в высушенном виде. Если все операции выполнены нестерильно, их можно затем простерилизовать под ультрафиолетом. Таким же образом производится обработка раствором коллагена.
Следует отметить, что в ряде работ имеются сведения о значении толщины пленки покрытия. При использовании polyHEMA проверяли толщину покрытия в диапазоне 35—0.0035 мкм. Клетки, посеянные иа самый толстый слой (35 мкм), были наименее прикрепленными и имели круглую форму; на более тонких слоях все клетки прикреплялись и распластывались [18, 19]. Такая же зависимость отмечена при посеве эпителиальных клеток кожи на коллагеновое покрытие [21]. Механизм этой реакции пока неизвестен.
Известно, что на заводах фирм, специализирующихся на производстве пластиковой посуды для культивирования клеток, эти изделия проходят специальную обработку, вероятнее всего электрическим коронным разрядом. Он может индуцировать на поверхности пластика мягкое окисление или разрушение различных агентов, остающихся на поверхности после литья [25].
К разряду физических способов относится и обработка плазмой кислорода [26].
Очень хорошие результаты получаются при обработке полистирола концентрированной серной кислотой. Для этого обычно используют концентрированную кислоту (93 и 98%) [16, 27, 28]. Время обработки колеблется от 2 мин до 18 ч. Есть и некоторые другие различия в условиях обработки; например [27J, при использовании 93 %-ной холодной кислоты, которую отмывали дистиллированной водой, посуду затем обрабатывали 10 %-ным раствором ЫагСОз в течение 20 мин для нейтрализации групп H2SO4, прикрепленных к пластику, и проводили следующее отмывание и стерилизацию ультрафиолетом в течение 30 мин (рис. 4).
В ряде случаев [13, 28] посуду обрабатывали концентрированной серной кислотой при 37 °С в течение 2, 10 мин и 18 ч. Результаты были прекрасные, в то время как обработка соляной кислотой, хлорноватой кислотой, гидролиз раствором 5 • 10~3 М КС1 или 10 М НС1 в течение 30 мин, озонирование 2 %-ным озоном при 25 °С в течение 25 мин улучшали адгезию клеток, но ие настолько, как в случае с серной кислотой. Обработка хромовой кислотой может
Рис. 4. Рост клеток иа бактериологических чашках (/ и 2) и на чашках для культур клеток (3) (по: [27]).
/—без предварительной обработки; 2—обработка УФ и №гСОз. По оси абсцисс— время после посева, ч; по оси ординат — количество клеток иа чашку.
индуцировать на поверхности полистирола гидроксильные, альдегидные или карбоксильные группы. Все эти способы обработки, вызывающие окислительные реакции на поверхности полистирола, улучшают адгезию клеток. Но пока еще не существует полного понимания природы адгезии клеток к субстрату. Одни авторы [13, 16, 27] полагают, что в основе механизма адгезии лежат физические силы взаимодействия субстрата (полистирол) с клеткой, проявляющиеся в величине и плотности возникающего заряда. Такой вывод был сделан из экспериментальных данных по измерению знака и величины заряда на обработанных и необработанных поверхностях. Количество отрицательно заряженных групп можно измерить по связыванию их положительно заряженным четвертичным аммониевым красителем кристаллическим фиолетовым. Оказалось, что чашки, предназначенные для культивирования клеток, связывают его в 5—10 раз больше, чем бактериологические [16, 27] v
Обработка концентрированной серной кислотой — сульфониро-вание — увеличивает адгезивность полистирола. Есть данные [16], что необработанные бактериологические чашки имеют плотность отрицательного заряда 0.6 на 1 нм2 при плотности заряда 2.3 (это значение соответствует полному сульфонированию поверхности), после сульфонирования распластанность клеток увеличивается в 5 раз. Но при дальнейшем увеличении плотности заряда до 17.2 распластывание клеток снижается в 2.5 раза (в бессывороточ-ной среде). Было обнаружено, однако, что клетки также хорошо распластываются на положительно заряженном полистироле. Следовательно, для адгезии будет иметь значение скорее величина плотности заряда, чем его знак.
