Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 162

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 156 157 158 159 160 161 < 162 > 163 164 165 166 167 168 .. 171 >> Следующая

Г = *
3.3 lg х/х° ’
где Т — интервал времени в часах, х° — начальная клеточная концентрация, х — конечная концентрация клеток, t — время культивирования.
Морфологическое изучение клеток проводят на препаратах, окрашенных по Гимза—Романовскому. При нарастании клеточной массы и достижении клетками плотности 1 • 106 клеток/мл и выше необходимо культуру пассировать и поддерживать ее на уровне (3—4)Х ХЮ5 клеток/мл.
Как правило, лимфоидные культуры клеток хорошо переносят криоконсервацию. Чаще всего в качестве криопротектора пользуются ДМСО, лучше отечественным или производства фирмы «Welcome».
Время экспозиции криопротектора с замораживаемым материа-
лом составляет 15—20 мин. Деконсервацию культур проводят в водяной бане при 37 °С. Клетки отмывают от криопротектора и культивируют обычным способом.
г Методы получения лимфоидных суспензионных ( постоянных клеточных линий
Получение лимфоидных суспензионных культур клеток из гемато-поэтических тканей осуществляется различными методами: культивирование всей клеточной массы органа; совместное культивирование мононуклеарной клеточной фракции органа с летально (при 6000 Р) облученными клетками культур, продуцирующих трансформирующие вирусы (лимфотропные герпесвирусы, ретровирусы); трансформация мононуклеарной клеточной фракции гематопоэтических тканей клинически здоровых индивидуумов после инфицирования клеток вирусами, обладающими трансформирующей активностью; культивирование стимулированных митогеном (ФГА) лимфоцитов.
Культивирование всей клеточной массы органа. При этом способе культивирования гематопоэтических тканей, как правило, уже через
1—2 сут отмечается активное прикрепление клеток к твердому субстрату. В случае культивирования костного мозга монослой фибро-бластоподобвых клеток может образоваться уже через 7 сут, а при культивировании селезенок — несколько позднее, монослой может и не образоваться. При культивировании лимфатических узлов фиб-робластоподобные клетки бывают единичными, но могут образовывать и мо^ослой. В случае культивирования лейкоцитов, содержащихся в надосадочной плазме гепаринизированной крови, центрифугированной 5 мин при 800—1000 об/мин, фибробластоподобные клетки также присутствовали в культуральных флаконах.
Лимфоидные элементы округлой формы располагаются на поверхности фибробластоподобных клеток и в жидкой фазе. На первых этапах культивирования ростовые преимущества имеют фибробластоподобные элементы, которые, активно пролиферируя, метабо-лизируют среду культивирования. Затем по мере культивирования ростовые потенции фибробластоподобных клеток уменьшаются, а лимфоидных элементов нарастают (рис. 1 и 2, см. вклейку).
Успех культивирования в какой-то степени зависит от интенсивности роста фибробластоподобных клеток, которые кондиционируют среду культивирования для лимфоцитов. Лимфоидные элементы, плотно или рыхло прикрепленные к фибробластоподобным клеткам, позднее отрываются от них, плавают в суспензии, образуя конгломераты разных размеров, видимые невооруженным глазом. Среда культивирования при этом становится интенсивно желтой и мутной. Через 20—60 сут от начала культивирования и лимфоидные элементы могут образовать суспензионную культуру, а фибробластоподобные элиминироваться совсем. Лимфоидные клетки при этом полностью теряют адгезивную способность и после перенесения в свежие флаконы размножаются там в жидкой фазе без признаков прикрепления к стеклу. Пролиферативная активность этих клеток, определяемая
по времени удвоения клеточной массы в единице объема, обычно составляет 18—72 ч. Количество живых клеток колеблется в пределах 80—95 %. Плотность клеточной массы в уже сформированной суспензионной линии может достигать (2—3) • 106 клеток/мл к 7-м суткам культивирования (рис. 3—7, см. вклейку).
В табл. 1, составленной по нашим материалам, представлена частота получения лимфоидных суспензионных линий клеток человека в зависимости от формы заболевания; Видно, что; наиболее часто (75 %) спонтанное становление лимфоидной линии происходит при культивировании лейкоцитов больных миелолейкозами, (острым и хроническим). В табл. 2 и 3 дана характеристика входящих в нашу коллекцию клеточных линий человека и обезьян.
Получение лимфоидных линий клеток при культивировании мононуклеарной клеточной фракции. В процессе культивирования мононуклеарных клеток, выделенных из кроветворных тканей, отмечаются резкие колебания в проценте живых клеток в зависимости от времени культивирования. В течение первых двух недель количество живых клеток постепенно снижается, достигая 40—45 % к концу
2-й или к середине 3-й недели. Для поддержания первоначальной концентрации клеток, т. е. (1—2) • 106 клеток/мл, содержимое различных флаконов можно объединять, убирая избыток среды культивирования. Через 3—4 нед начинает медленно нарастать за-кисление среды культивирования. Одновременно появляются и увеличиваются в количестве конгломераты клеток, плавающие в суспензии и видимые невооруженным глазом. Уже сформированная таким образом культура не отличается от других и культивируется обычным способом (рис. 8 и 9, см. вклейку).
Предыдущая << 1 .. 156 157 158 159 160 161 < 162 > 163 164 165 166 167 168 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed