Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Клеточные линии получаются спонтанно при культивировании периферической крови и лимфоидных тканей больных лимфомами и лейкозами, а также клинически здоровых людей и обезьян, имеющих антитела к лимфотропным вирусам герпеса, вирусу Эпстайн-Барр (ВЭБ) человека и лимфотропному герпесвирусу павианов (ГВП) [5—11]. Успешное получение лимфоидных клеточных линий
от взрослых серопозитивных людей и обезьян — это скорее вопрос техники культивирования, так как к настоящему времени от любого серопозитивного индивидуума можно получить лимфоидную клеточную линию. Большинство таких линий имеет В-, а часть — Т-клеточ-ную природу; кроме того, некоторые из них не относятся ни к той, ни к другой.
Открытие в 1976 г. Морганом фактора роста Т-лимфоци-тов (TCGF), который позднее был идентифицирован как интерлейкин-2 (ИЛ-2), сделало возможным культивирование зрелых человеческих Т-клеток нормального и неопластического происхождения, результатом которого явилось становление постоянных клеточных линий. ИЛ-2, являющийся компонентом кондиционированной среды из митоген-стимулированных лимфоцитов, способен поддерживать in vitro клоны активированных специфическим антигеном Т-клеток и дает возможность пролиферировать in vitro различным Т-клеткам (хелперам, супрессорам, цитотоксическим Т-лимфоцитам), а также НК -клеткам. В части случаев полученные с помощью ИЛ-2 культуры в дальнейшем не требуют этого фактора, а в других случаях полученные культуры остаются факторзависимыми.
В НИИЭПиТ АМН СССР имеется коллекция выведенных в лаборатории экспериментальной онкологии клеточных суспензионных постоянных лимфоидных линий, полученных от больных опухолевыми заболеваниями и клинически здоровых людей и обезьян [6, 11 —15]. Все они имеют В-клеточное происхождение, так как продуцируют поверхностные и цитоплазматические иммуноглобулины и не образуют розеуки с эритроцитами барана [16—18]. В некоторых клеточных линиях обезьян происходит репликация лимфотропного герпес-вируса павианов (ГВП), а в человеческих — лимфотропного герпес-вируса человека.
Культивирование
Асептически взятые кроветворные ткани (кровь, селезенка, костный мозг, лимфатические узлы), а при наличии опухоли ее кусочки тотчас подвергают обработке. Селезенку, лимфатические узлы и опухоль после контакта с антибиотиками тщательно измельчают ножницами и суспензируют в питательной среде. При необходимости суспензию фильтруют через марлевый фильтр для удаления крупных комочков ткани. Кровь берут в гепарин (40—50 ед гепарина на 10 мл крови). Гепарин предварительно разводят и хранят при 4°С под ватно-марлевой пробкой для испарения консерванта. Гепарини-зированную кровь центрифугируют 5 мин при 500—800 об/мин. Над-осадочную жидкость, представляющую собой плазму с лейкоцитами, отсасывают пастеровской пипеткой и ресуспензируют в питательной среде. Костный мозг отсасывают пастеровской пипеткой из трубчатых костей и суспензируют тотчас в питательной среде. Хорошие результаты дает культивирование мононуклеарной фракции крови, выделяемой низкоскоростным центрифугированием в градиенте фиколл-верографина.
Выделение мононуклеаров крови, селезенки и костного мозга проводят по уже описанной и модифицированной в лаборатории экспериментальной онкологии НИИЭПиТ АМН СССР методике [19]. Градиент готовят следующим способом: к 20 мл 76 %-ного раствора верографина («Spofa») добавляют 25 мл дистиллированной воды, после чего к 40 частям этого раствора прибавляют 96 частей 9 %-ного раствора фиколла-400 («Pharmacia»), приготовленного на дистиллированной воде. Компоненты тщательно перемешивают, стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры «Millipore» (HAWP, 0.45 мкм) и хранят при 4 °С. Три объема крови, разведенной питательной средой (без сыворотки) 1 : 4, или суспензию органа, содержащую (3—5) • 106 клеток/мл, наслаивают на градиент и центрифугируют на холоду (4 °С) в течение 30 мин при 1200 об/мин. Мо-нонуклеарную фракцию, состоящую в основном из лимфоцитов, сосредоточенных в интерфазе, отсасывают пастеровской пипеткой, дважды отмывают питательной средой от градиента, подсчитывают и ресуспензируют в питательной смеси, состоящей из питательной среды RPMI-1640 в сочетании с 15 % эмбриональной сыворотки коров, инактивированной прогреванием в течение 30 мин при 56 °С, L-глютамина (300 мг/мл), пенициллина (100 мг/мл) и стрептомицина (50 мг/мл). Инкубирование осуществляют в стационарном состоянии в термостате при 37 °С в атмосфере 5 % СОг и 95 % воздуха.
Первичная посевная концентрация клеток лимфатических узлов, селезенки и костного мозга составляла (3—5) • 106 клеток/мл, а клеток крови (1—3) • 106 клеток/мл.
Микроскопирование культур проводят ежедневно, а смену среды в начале культивирования через 1—2 сут по '/з—’Д объема, затем раз в неделю, а после становления культуры — по мере закисления.
Подсчет количества живых клеток осуществляют с помощью 0.2 %-ного раствора трепанового синего, который в равном объеме соединяют с клеточной суспензией.
Время удвоения клеточной массы в логарифмическую фазу роста рассчитывают по формуле
