Практикум по гистологии, цитологии и эмбриологии - Юриной Н.А.
ISBN 5-209-00126-1
Скачать (прямая ссылка):
1. Депарафинирование срезов (см. схему 2).
2. Окрашивание раствором метилового зеленого-пиронина — 10—30 мин.
3. Быстрое (в течение нескольких секунд) промывание в ди-сти л л и р ов а ино й в о де.
4. Высушивание срезов фильтровальной бумагой.
5. Быстрое обезвоживание в ацетоне.
6. Быстрое ополаскивание в смеси, состоящей из равных количеств ацетона и ксилола.
7. Просветление в двух порциях чистого ксилола.
8. Заключение в бальзам.
При этом ядра окрашиваются в зеленый или сине-зеленый цвет, а РНК цитоплазмы — в красный.
Приготовление препаратов (объектов) для прижизненного изучения клеток и тканей
Объектами прижизненного изучения могут служить топкие тканевые пленки (брыжейка, плавательная перепонка лягушки) > клетки крови, клетки в культуре тканей и др. При суправитальном исследовании клетки помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора или специальной питательной среды, накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом.
Прижизненные исследования требуют применения специальных методик микроскоппрования без использования красителей: фазовоконтрастиая, темно но л Ы! а я, н о л я р и з а ни он н а я, л юм и и есцсити а я, у л ьт р а ф иол етеш а я м и к р оско -пия. Примером суправиталыюго окрашивания может служить окрашивание бриллианткрезиловым сипим ретикулоцитов крови, которое широко используется в клинике в качестве диагностического теста для оценки интенсивности кроветворения.
Схема 6. Суправитальиое окрашивание ретикулоцитов
1. Поверхность тщательно вымытого предметного стекла покрывается тонким слоем красителя (1% водного раствора брил-лианткрезилового синего в 100° спирте) и высушивается на воздухе.
2. На предметное стекло со слоем красителя наносится капля крови и с помощью покровного стекла приготовляется мазок.
3. Мазок сразу помещается во влажную камеру (хорошо за-
крытую чашку Петри, обложенную влажной фильтровальной бумагой).
4. Мазок извлекается из чашки Петри и высушивается на воздухе.
5. Мазок исследуется под микроскопом и при этом обнаруживается, что эритроциты окрасились в сине-фиолетовый цвет, а в отдельных эритроцитах (ретикулоцитах) видна зернистая субстанция.
Основные этапы приготовления препаратов для электронно-микроскопического исследования
Взятие и фиксация кусочков тканей и органов. Кусочки размером не более 1 мм3 вырезают острой бритвой и быстро помещают в специальные фиксаторы — глютаральдегид, а через 1,5 ч —- в четырехокнсь осмия, Для создания оптимального pH при фиксации (7,3—7,4) используют буферные растворы, Лучшие результаты дает метод последовательной фиксации сначала в г л гота р альдегиде (стабилизирует белки), а затем в 1% растворе че-тырехокиси осмия (OSO4) (стабилизирует фосфолипиды). Фиксация проводится при комнатной температуре в течение нескольких часов.
Промывание кусочков в буферном растворе с pH 7,3—7,4.
Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации — 50°, 60°, 70°, 80°, 90°, 100°.
Заливка производится в специальные синтетические смолы (эпоксидные, эпон+аралдит), которые способны полимеризироваться и затвердевать. Кусочки помещают в капсулы, заливают жидкой эпоксидной смолой, затем помещают в термостат, где при температуре 58° происходит полимеризация (затвердение) смолы, и таким образом получают маленькие «блоки», с которых можно приготавливать срезы.
Приготовление срезов. Ультратошше срезы толщиной 400—800 нм получают на ультрамикротомах. Используют стеклянные или алмазные ножи. Срезы переносят на металлические сеточки.
Иногда на ультратоме предварительно готовят полутонкие срезы толщиной 1—2 мкм, которые окрашивают, например, метиленовым синим и рассматривают с помощью светового микроскопа для ориентации в локализации иитересующих структур в исследуемых тканях или органах. После определения нужного участка далее готовят именно из этой части блока ультра-тонкие срезы.
Окрашивание (контрастирование) срезов проводят солями тяжелых металлов— свинца, вольфрама, ураиилацетата. Соли этих металлов осаждаются в структурах клеток и задерживают электроны, проходящие через объект в электронном микроскопе, что обеспечивает появление более темных участков в изображении, т. е. создание контрастности.
Схема 7. Приготовление биологических объектов для электронной микроскопии
1. Быстрое взятие кусочков размером 0,5—-1,0 мм3.
2. Фиксация в 3,5% буферном растворе глютаральдегида — 1 ч.
3. Промывание в буферных растворах (pH 7,3—7,4) — 3 раза по 5 мин.
4. Фиксация (постфиксация) в растворах, содержащих че-тырехокись осмия — 1—2 ч.
5. Промывание в буферных растворах — 3 раза по 5 мин.
6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации—¦ 50°, 60°, 70°, 90°, 100° (по 15 мин в каждом).
7. Пропитывание эпоксидными смолами — 24 ч.
8. Заливка эпоксидными смолами (эпон, аралдит) с добавлением катализатора, ускоряющего полимеризацию смол, и помещение в термостат с температурой 58° — 2 сут.
