Практикум по гистологии, цитологии и эмбриологии - Юриной Н.А.
ISBN 5-209-00126-1
Скачать (прямая ссылка):
Схема 1. Подготовка гистологического материала и приготовление парафиновых срезов
I. Фиксация небольших кусочков (0,5—1 см3) органов в 10% формалине — 24 ч.
II. Промывание кусочков в воде — 24 ч.
III. Заливка в парафин:
1) обезвоживание кусочков проводкой по спиртам возрастающей крепости — 60°, 70°, 96°, 100°, 100° (в зависимости от характера материала от нескольких часов до 1 суток в каждом);
2) выдерживание в смеси равных частей 100° спирта и ксилола — 1,5—3 ч;
3) » в первом чистом ксилоле— 1,5—3 ч;
4) » во втором чистом ксилоле—1,5—3 ч;
5) » в насыщенном растворе парафина в ксилоле —
2 ч (в термостате при 37°);
?>) » в первом чистом парафине— 1,5—2 ч (в термо-
стате при 54—56°);
7) » во втором парафине (содержащем 2—5% пче-
линого воска) — 1 —1,5 ч (в термостате 54—56°);
а) заливка материала парафином в бумажные или металлические формочки;
9) охлаждение в воде;
10) наклеивание на деревянные кубики и хранение на воздухе.
IV. Получение срезов;
1) получение па санном микротоме срезов толщиной 4— 6 мкм;
2) помещение срезов на предметные стекла в каплю дистиллированной воды и расправление их при легком подогревании иа специальном столике (избыток воды убирается фильтровальной бумагой);
3) помещение предметных стекол со срезами на лотки и высушивание их в термостате при 37°.
Применяют также другие методы заливки, например заливку в целлоидин.
Схема 2, Окрашивание парафиновых срезов гематоксилин-эозииом
I. Д ен а р аф и ниров а мне:
1) удаление парафина из срезов в трех порциях ксилола — по 3—5 мин в каждом;
2) удаление из срезов ксилола с помощью 100° спирта — 2—3 мин;
3) удаление из срезов спирта путем проведения по спиртам снижающихся крепостей — 96° и 70° по 2—3 мин в каждом и затем помещения в дистиллированную воду на 1—2 мин.
II. Окрашивание срезов:
1) помещение среза в водный раствор гематоксилина — 2—3 мин;
2) » в водопроводную воду — 5—10 мин;
3) » в дистиллированную воду — 2—5 мин;
4) » в водный раствор эозина — 0,5—1 мин;
5) » в дистиллированную воду — 0,5—1 мин.
III. Обезвоживание срезов и заключение в бальзам:
1) обезвоживание срезов в 70°, затем в 96° спиртах по 1 —
2 мин в каждом;
2) просветление срезов в ксилоле — 2 мин;
3) заключение срезов в бальзам;
4) помещение стекол со срезами на лотки для просушива-
ния в термостате.
Помимо описанных классических методов окраски существуют и другие для выявления различных клеточных и тканевых структур: азур 2 — эозином (для выявления клеток крови и соединительной ткани), пикрофуксином (для выявления мышечных, соединителы-ю-ткаиных и эпителиальных структур), импрегнация серебром, основанная на способности микроструктур удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов — серебра, свинца, осмия, золота (для выявления нервных элементов), окраска судаком (для выявления жира в ткани) и др.
Приготовление препаратов для цито- и гистохимических исследований
Цито- и гистохимические методы исследования позволяют выявить в микроструктурах различные вещества — белки, жиры, углеводы, ферменты, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), витамины, минеральные вещества. Фиксаторы и красители выбираются в соответствии с тем, какие химические компоненты необходимо выявить.
Наиболее часто возникает необходимость выявления ДНК и РНК (методы Фельгена и Эйнарсоиа) гликогена — ШИ К-реакция, окислительных ферментов (нитросиний тетразолнй) и др. В специальных руководствах по гистохимии дается описание многочисленных цито- и гистохимических методов (Пирс, 1962 и др.). Приведем примеры различных способов выявления ДНК и РНК.
Схема. 3. Выявление ДНК с помощью реакции Фельгена
1. Ополаскивание депарафинированиых срезов в 1 N HCL
2. Помещение для гидролиза в 1 N НС1 на 3—8 мин (продолжительность гидролиза зависит от фиксатора) в термостате при 60°.
3. Быстрое ополаскивание в 1 N НС1 и затем в дистиллированной воде.
4. Перенесение в реактив Шиффа — 0,5—1 ч.
5. Ополаскивание в трех порциях свежеприготовленного раствора бисульфита (5 мл 10% K2S2O5, 5 мл 1 N НС1, воды до 100 мл).
6. Ополаскивание в воде.
7. Докрашивание 0,5% раствором прочного зеленого —
0,5—1 мин.
8. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации.
9. Просветление в ксилоле.
10. Заключение в бальзам.
Схема 4. Метод выявления ДНК и РНК акридиновым оранжевым
1. Нанесение па срезы 0,1% раствора акридинового оранжевого в дистиллированной воде— 15 мин.
2. Удаление красящего раствора фильтровальной бумагой и нанесение на срезы забуференпого раствора Кребса—Рингера.
3. Исследование срезов в люминесцеитом микроскопе. При этом ДНК флюоресцирует зеленым светом, а РНК — красным.
Схема 5. Окрашивание срезов метиловым зеленым-пиронином
