Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
ВСЯ ИНФОРМАЦИЯ, НЕОБХОДИМАЯ
ДЛЯ ПРОЦЕССА РЕПЛИКАЦИИ, ЗАКЛЮЧЕНА В ДНК
Доказательство этого положения получено при изучении синтеза ДНК в бесклеточиоп системе Е. coli. Был обнаружен ферменг ДНК полимераза I, который соединяет дезоксинуклеотиды в процессе сии гена ДНК 3', 5' ди эфирны ми связями (рис 9 8). Этот фермент функционирует только в присутствии ДНК затравки, которая определяет порядок расположения нуклеотидов в продукто синтеза Сама по себе ДНК-полимераза не может определить последовательность нуклеотидов, она способна обеспечить лишь построение регулярной (углеводпо-фосфатпой) части молекулы Это отчетливо демонстрируют эксперименты, в которых затравкой служит ДИК из различных источников с разным содержанием нар \ - Т и Г - • Ц. Образовавшийся продукт всегда имеет такое соотношение оснований, какое имела ДИК-затравка (табл. 9-2).
Таблица 9-2 Сравнение нуклеотидного состава ДНК синтсчироваппоп при помощи ДНК полимеразы в присутствии еоотиотствугощгн матричной ДНК
Есточпнк матричной ДНК Доля данного нуклготица в продукте А+ Т
Ф | моптативноВ. реакции г+ц
А Т 1 Ц в про рице
дукте
М icrocaccns b/sodeikticus 0 15 0,15 0,35 0,35 0 41 0 39
0 22 0,22 0.28 0,28 0,80 0.82
0.2о 0 25 025 0 25 1.00 0,67
0.2(1 0.28 0.21 0 22 1,32 1.35
0,32 0.32 0,18 0,18 1,78 1.84
В процессе бесклеточпого синтеза ДНК пе происходит синтеза белка или молекул каких либо других классов Это убедительно доказывает, что не существует ппкаких промежуточных переносчиков генетической специфичности гепов. Нет сомнения, что именно сама ДНК играет роль матрицы при своем воспроизведении. Молгао было ожидать, что продукт даппои ферментативной реакции будет иметь, подобно затравке, структуру двойной спирали, п эксперименты подтверждают это предположение О трехмерной структуре ДНК полимеразы I имеется очень мало данных, поэтому точно не известио. как она работает на молекулярном
Тимин | -Дезоксирибоза 5-'^») Гуанин I -Дезоксирибоза~5-'й>)
--------- ^
[цшо}И1|| -Дезоксирибоза 5-^)
Аленин-дезоксирибоз а-®~
| Тимин | -Дезоксирибоза 5^(ф) _________ 3
Гуанин | -Дезоксирибоза5-^) 3'-
|цитозин| -Дезоксирибоза?^^)
Аденнн ~|-Дезоксирибоза?^)4- |(Ф)(Ф)|
ч
2©
I Пирофосфата га
Рис 9-8. Ферментативный синтез ДНК.
уровне Очистка больших количеств фермента — очень трудная задача, поскольку оп присутствует в клетках и весьма ограниченном количестве. Известпо, однако, что его молекула состоит из одной полппептнднои цепи, содержащей около 1000 аминокислот- Рано или поздно фермент удастся закристаллизовать, и тогда откроется возможность исследовать его трехмерную структуру с помощью дифракции рентгеновских лучей
Способность ДНК-полимеразы I делать комплементарные копни цепей ДНК влечет за собой предположение, что она должна быть основным ферментом Е. coli, участвующим п соединении нуклеотидов при реп ликацип ДНК. Однако, как мы увидим далее, репликация ДНК в целом представляет собой сложный процесс, в котором участвует несколько различных полимеризующпх фермептов Открытие первой ДНК-полимеразы имело тем не менее огромное значение, так как благодаря ему было показано, что сборка комплементарных последовательностей нуклеотидов поддается изучению в пробирке сравнительно простыми методами
УБЕДИТЕЛЬНЫЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА РАЗДЕЛЕНИЯ ЦЕПЕЙ ДНК
Эти доказательства удалось получить после того, как были разработаны специальные методы разделения родительских и дочерних молекул ДНК Сначала такое разделение было осуществлено при помощи тяжелых изотопов, например 15N. Предварительно бактерии выращивали на среде, содержавшей l5AJ. ДНК из таких бактерий имеет более высокую плотность, чем ДНК из клеток, выращенных в обычной среде. Тяжелую ДНК можно отделить от легкой путем равновесного центрифугирования в кои центрированных растворах солеи тяжелых металлов, например в растворе хлористого цезяя При центрифугировании молекулы распределяются в центр ифулшой пробирке в соответствии со своей плотностью (болео тяжелые ближе ко дну). Если правильно подобрать исходную плотность раствора, то в равновесном состоянии молекулы ДНК каждого типа займут ту область в растворе соли, которая соответствует их собственной плотности. В описываемых экспериментах бактерии, содержавшие тяжелую ДНК, переносили в легкую среду (AaN) и давали им возможность в тече-пие некоторого времени расти в этой средс. В данных условиях повоенн-тезировапная ДНК содержала уже l4N, и потому ее легко можно было отделить от ДНК, синтезированной до переноса в легкою среду.
Если репликация ДНК действительно идет с разделением цепей, то можно предсказать, какой должна быть плотность молекул ДНК через различные промежутки времени носле переноса бактерий в легкую среду После одной генерации в легкой среде все молекулы ДНК должны содер жать одну тяжелую и одну легкую цепь, и, следовательпо, они будут иметь промежуточную плотность Имеппо этот результат и был обнаружен в эксперименте После двух генерации половину должны составлять легкие молекулы и половину — гибридные (рис. 9 9); что предсказание также подтвердилось.
