Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
о нуклеотидных последовательностях, расположенных в самом начале геиов Shine I , Dalgarno Z , The 3‘-Terminal Sequence of E coli 16S rRNA Complementarity to Nonsense Triplets and Ribosome Binding Sites В работе обсуждается вопрос о том каким образом происходит первоначальное связывание мРНК с рибосомной 308-еубчастицсй.
ГЛАВА
13
Генетический код
Даже после того, как роль РНК в белковом синтезе в основном выяснилась (1960 г ), ученые не склонны были особенно оптимистически расценивать перспективы расшифровки генетического кода Предполагали, что идентификация кодонов (для каждой отдельпой аминокислоты) потребует точного выяснения как последовательности оснований в гепе, так н последовательности аминокислот в белковом продукте гена. Выше мы отмечали, что определение последовательности аминокислот в белках было уже в то время задачей хотя и трудоемкой, но вполне разрешимой. Иначе обстояло дело с определением последовательпостей оснований в ДНК, так как применявшиеся для этой цели методы были весьма примитивными Только сейчас такого рода работы начинают интенсивно развиваться К счастью, однако, оказалось, что трудности, связанные с расшифровкой кода, переоценивались: уже через год после открытия мРНК (т. е в 1961 г ) благодаря использованию синтетической мРНК началось «взла мывапие» кода Первым был однозначно определен кодой для аминокислоты фепилаланина. Для того чтобы объяснить, как это было сделано, мы должны прежде всего описать некоторые детали исследований по синтезу белка в бесклеточных системах.
ДОБАВЛЕНИЕ мРНК СТИМУЛИРУЕТ СИНТЕЗ белка ш vitro
На экстрактах из клеток, активно синтезирующих белки, была доказана необходимость участия в этом процессе трех классов РНК* тРНК, рРНК и мРНК В этих опытах клетки тщательно разрушали и пояучеппые бес-клеточные препараты фракционировали, чтобы определить, какие именно клеточные компоненты необходимы для вктючения аминокислот в белки Поскотьку в бесклеточных системах синтез белка протекает очень слабо (и обнаружить реальпмй прирост белка обычно но удается), во всех этих опытах использовали аминокислоты, меченные радиоактивными изотопами (ЭП, 14С или 35S) Только использование метки позволяет убедительно продемонстрировать включение аминокислот в белки (рис 13-1).
Типичный ход такого процесса представлен на рис 13-2. Мы видим, что в экстрактах из клеток Е. coli синтез белка в течение нескольких минут идет линейно, а затем постепенно замедляется и наиопец прекращается вообще. Одповремеппо исчезает соответствующая мРНК, которую быстро разрушают ферменты, присутствующие в эистракте Это позволило предположить, что главная причина малой эффективности синтеза белка в беек неточных экстрактах заключается в потере матриц. Правильность такого заключения была доказана путем добавления к системе, в которой синтез приостановился, новой порции мРНК. Это добавление немедленно восстановило синтез белка. Экстракты, бедные мРНК, весьма удобны
т
I
Рис. 13-1 Изучение синтеза белка ш vitro. /. Быстро растущие кдегки Е. coli собирают путем центрифугирования на холоду (0°С) и разрушают для получения клеточного сока. Добавляют дезоксирибонуклеазу (фермент, разрушающий ДНК). Б. Клеточный сон центрифугируют (0°С), чтобы удалить фрагменты клеточных оболочек и мембран- Затем собирают более медленно седиментиругащие компоненты (нолирибосомы. свободные рибосомы, свободную мРНК тРНК и ферменты) ir поме-
щают в иробиркн Вносят в каждую пробирк? АТФ, 1ТФ и радиоактивные аминокислоты; инкубируют при 37°С в течение различай промежутков времени В Добавляют кислоту для осаждения белков (свободные аминокислоты остаются при этом в растворе) Осада собирают, промывают и помещают в счетга для измерения радиоактивности Величин! радиоактивности осадка служит мерой количества включенных аминокислот (т е интез-сшшости белкового синтеза)
Рис 13-2 Влияние добаилеввя мРНК на включение ашшокнелот в белок в бес клеточных экстрактах Е coli (ври 37°С).
- включение аминокислот II — распад исходной мРНК III — распад добаилеиной мРНК.
для тестировании мРНК Поскольку они содержат очень мало функционирующей мРНК, они могут быть использованы для обнаружения даже слабой матричной активпости в добавляемых извне препаратах мРНК.
ВИРУСНАЯ PITK ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОЪОЙ мРНК"
В п 15 мы увидим, что генетический компонент многих вирусов представлен одноцепочечной РНК. Когда такие вирусы инфицируют клетку, их ГНК должна сначача сыграть роль матрицы при синтезе специфических белков, без которых не может начаться жизненный цикл вируса. К числу этих необходимых бет ко в относится и фермент РНК-синтетаза, катализирующий репликацию РНК Поэтому нифицирующая одноцепочечная молекула PIIK не может служить матрицей для синтеза комплементарной цени до тех пор, пока она пе выполнит роль матрицы в белковом синтезе Это означает, что инфекционная вирусная РНК сама должна быт!» способна связываться с клеточными рибосомами и направлять синтез вирус-специфнческих бечков (т. е. она должна действовать как мРНК). Опыты с бесклеточными системами доказывают это весьма наглядно Так, например, добавление PIIK ВТМ к экстракту Е coh, в котором запасы мРНК исчерпаны, немедленно стимулирует включение аминокислот в белки
