Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
«ГОРЯЧИЕ ТОЧКИ» НЕРЕДКО ПРЕДСТАВЛЯЮТ СОБОЙ УЧАСТКИ, В КОЮРЫХ ПРОИСХОДИТ НГПР-ШИЛЬНОЕ СПАРИВАНИЕ ОСНОВАНИЙ
Описанная выше модель образования вставок (делении) предполагает, что вероятность их возникновения зависит от последовательности соседних оснований Чем длиннее последовательность повторяющихся основании, тем выше частота мутаций- Данные, подтверждающие эту гипотезу, бьпн
получены при изучении фагоспецифического фермента лизоцима, который кодируется ДНК фага Т4 При исследовании вставок и делецин в экспериментах, подобных описанным в следующем разделе, были получены некоторые данные о пуклеотидпой последовательности ДНК фага 14 И ней, согласно этом данным, имеется один высокомутабильный участок («горячая точка»), в котором происходит мутация, приводящая к выпадению одного остатка аденина из последовательности, состоящей из шести остатков аденииа (6А) Обратная мутация, х^оторая приводит к добавлению одного остатка А к участку, состоящему из 5 остатков А, происходит в 100 раз реже, чем прямая мутация Таким образом, весьма вероятно, что частота мутации, приводящей к вставке (делеции), является функцией числа идентичных повторяющихся оснований (например, дуплетов, триплетов оснований и т. д.)’
САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ
До недавнего времени мы считали, что нуклеазы, участвующие в рекомбинации, инициируют этот процесс, разрывая только одну цепь двойной свирали ДНК Трудно было представить себе, каким образом могла бы воссоединиться полностью разорванная спираль. Однако теперь ми предполагаем, что инитщация определенных типов сайт-снецифической рекомбинации происходит в результате образования двух (смещенных относительно друг друга) разрывов под действием нуклеаз, которые разрывают двойную спирать ДНК только после связывания со строго специфическими нуклеотидными последовательностями. Образующиеся в результате .этих разрывов фрагменты могут затем спариваться с новыми партнерами, что приводит к перестройке исходного генетического материала. Например, при образовании смещенных относительно друг друга разрывов в двух
AI АЦГ VI I апцт Т11ТГАЧ ЦАТ ГГ А
АГАЦТАГТАЦЦТ ТЦТГАТЦАТГГ А
—
АГАЦТАГТА
TUT
ЦЦ1
Г AT LI АТ Г1 \
АГАЦТАГТА ЦЦТ
ТЦТ ГАТИАТГГА
«юмкшт икк
Рнс 10-22. Кроссинговер между фрашенталл ДНК с липкими концами, образовавшимися сод действием сайт-специфичсскон пуклеазы-
Ai АЦ [ АГТАЦЦТ
ТЦТ1 ATIIaH I А
АГАЦТАГТАЦЦТ ТЦТГАтЦАТ ГГА
Сайт прикрепления фага А
И нтеграга
С ийт прикрепление хромосомы Е. coli
Кольисвая форма ДНК фага Я.
Рис 10-23 .Механизм сайт-специфиадскоп ре-комбинации между ДНК фага & л хромосомой Е, coli.
I Образование липких концов в результате смещенных относительно друг друга разрывов комплементарных цепей ДНК иод действием сашг-сдсцифической пуклеазы (интегразы)
II Интеграция ДНК фага Я с хромосомой F coli, завершающаяся заделыванием пробелов п устранением разрывов с помощью
двойных спиралях, каждая из которых содсри-гит одии и тот же сайт уапавания, возникает возможность кроссииговера между этими двумя спиралями (рис. 10-22)
В рекомбинации могут участвовать, вероятно, тотько т-ише ферменты, которые узнают достаточно длинные нуклеотидные последовательности’, если бы в молекуле ДНК присутствовато иескотько утаетков узнавания, это могло бьт привести к полному нарушению первоначального порядка расположения генов. Допустим, в узнавании принимает участие около десяти пар оснований, в этом случае в молекуле ДНК, равной но длине хромосоме F coli, может случайно оказаться только один такой участок Бозмокно, именно благодаря действию фермента, узнающего длинные нуклеотидные последовательности, кольцевая молекула ДНК фага Я может включаться в рецепторный участок хромосомы E.coli (рис 10-23) В отличие от сайт-специфической рекомбинации общая рекомбинация у бактерии вряд тп мопа бы осуществляться с участием ферментов, производящих смещенные относительно друг друга разрывы в двойпой спирали ДНК, поскольку, как уже отмечалось выше, действие любой пуклеазы, узнающей многие участки, привело бы к быстрому нарушению исходного расположения генов
иП шзмила PSC.
- Хромосома ? coli
Рис 10-24- Использование специфических смещенных относительно друг друга разрывов цепей ДНК под действием нуклеазы Eco Rx для включения фрагментов ДНК дрозофилы в ДНК плазмиды Е colt.
А Очистка илазмицной ДНК Б. Очищенная ДН!\ подвергается действию фермента рестрикции Rj, который расщепляет нлазмидп} ю ДНК в одном месте, а ДНК дрозофилы во многих местах с образованием большого коли-
чества фрагментов разной величины. В Очистка ДНК дроиофилы. Г. Случайное соединение фра1 ментов и устранение разрывов с помощью лигазы Д Набор плазмид, содержащих различные фрагменты ДНК дрозофилы. Е. Клетка Е coh, не содержащая плазмиды. Ж Перемешивание рекомбинантных плазмид с клетками Е. coli в среде с высоким содержанием СаЕ*
