Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Полярография представляет собой черезвычайно чувствительный метод, позволяющий работать с очень разбавленными растворами и небольшими объемами. С помощью полярографии можно выявить наличие того или иного вещества в препарате (например, витаминов, гормонов, аминокислот) и определить его истинную концентрацию. (Иногда, правда, вещество необходимо соответствующим образом обработать). Метод позволяет получить данные по окислению и восстановлению даже в том случае, когда этого не удается сделать никаким другим способом. С помощью полярографии изучают как быстрые, так и медленные реакции, ее широко используют и при работе с ферментами (например, каталазой и перокси-дазой). Метод находит также применение в клинике, в том числе при диагностике раковых заболеваний.
Основной недостаток полярографии заключается в том, что для интерпретации получаемых результатов требуется значительный опыт, кроме того, побочные эффекты довольно часты и не всегда легко устранимы. В связи с этим полярографический метод не слишком широко применяется в биохимических лабораториях, и для проведения подобного рода исследований зачастую пользуются более удобными методами.
На рис. 7.8 представлен простой прибор для записи поляро-грамм вручную. Капельный ртутный электрод состоит из резервуара со ртутью, переходящего внизу в длинную трубку с капилляром на конце, из которого ртуть капает в исследуемый раствор. Вес столбика ртути подбирается таким образом, чтобы капли ртути образовывались с нужной скоростью; размер капель определяется диаметром капиллярной трубки. (Нужно принять меры предосторожности, чтобы избежать вдыхания паров ртути). Капельный ртутный электрод обычно (но не всегда) является катодом, а слой ртути на дне сосуда с раствором (рис. 7.8) играет роль анода. В усовершенствованных моделях этот слой заменен каломельным электродом, соединенным с раствором солевым мостиком.
Изменение разности потенциалов между электродами осуществляется с помощью потенциометра. Сила возникающего при этом тока измеряется гальванометром. Исследуемый раствор не должен со-
236 Часть III. Аналитические методы
Рис. 7.8. Простейшая полярографическая цепь.
1 — капельный ртутный электрод; 2 — гальванометр; 3 — исследуемый раствор; 4 — ртутный анод; 5 — потенциометр.
держать кислорода, который может восстанавливаться электролитически и искажать результаты. Поэтому перед началом работы через раствор пропускают какой-либо инертный газ, например азот, а затем изолируют раствор от атмосферы. В этих экспериментах капельный ртутный электрод является рабочим (или индикаторным). Он способен «поляризоваться» (сила тока по мере достижения этим электродом прилагаемого к нему потенциала если и возрастает, то очень незначительно). Поверхность электрода в результате образования ртутных капель постоянно обновляется, и поэтому продукты реакции его не загрязняют. Второй электрод не поляризуемый.
Получаемая зависимость силы тока от напряжения называется подпрограммой (рис. 7.9); она может состоять из серии волн. В начале сила тока очень мала и по мере роста напряжения не возрастает, поскольку происходит зарядка капельного ртутного электрода. Увеличение потенциала до значения, при котором происходит восстановление иона, приводит к тому, что в этой области небольшое возрастание напряжения сопровождается значительным увеличением силы тока («волна»). Потенциал полуволны (?1/2) является величиной, характерной для данного соединения, и может быть использован для его идентификации. При дальнейшем увеличении напряжения сила тока достигает некоторой постоянной величины, так как все ионы, достигающие электрода, сразу же восстанавливаются. Это так. называемый предельный ток, определяемый скоростью диффузии, которая прямо пропорциональна концентрации. Таким образом, после предварительной калибровки прибора с помощью стандартных растворов по высоте волны можно определить концентрацию вещества. Если потенциал продолжает возрастать до такой величины, при которой начинается восстановление другой разновидности ионов, возникает новая волна. По ходу записи на полярограмме часто возникают небольшие^ коле-
Гл. 7. Потенциометрия, электрометрия и полярография 237
Приложенное
напряжение
Рис. 7.9. Типичная полярограмма восстановления катиона.
бания, обусловленные изменением поверхности капли ртути, висящей на конце капиллярной трубки.
Описываемые здесь волны представляют собой «диффузионные волны» и бывают катодными (при восстановлении) или анодными (при окислении). Для изучения восстановительных процессов наиболее удобен капельный ртутный электрод, а при окислении менее легко окисляемых соединений пользуются вращающимся платиновым электродом или угольным электродом. Другой разновидностью волны является «кинетическая волна», при которой сила тока определяется химической реакцией, происходящей на электроде. Этот фактор используется для изучения некоторых ферментативных реакций. Белки и полипептиды, содержащие цистин, сам цистин и сыворотку крови можно исследовать с помощью реакции, известной как реакция Брдичка.
