Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
С помощью красителей удается определить внутриклеточную локализацию и активность какого-либо фермента на специально приготовленных тканевых срезах (гистохимическое окрашивание). Чаще всего применяют различного рода соли тетразолия, так как продукт восстановления (формазан) представляет собой нерастворимое ярко окрашенное соединение и местоположение осадка указывает на участок ферментативной активности. Ферменты, прочно связанные с мембранами (такие, как сукцинатдегидрогеназа), обнаружить легко, но растворимые ферменты могут диффундировать из тканевых срезов, если не предпринять специальных мер. Для предотвращения диффузии срезы предварительно обрабатывают поливиниловым спиртом, что удерживает ферменты внутри ткани. Количественные данные по ферментативной активности можно получить с помощью микроденситометрии или элюировав формазан и определив его количество спектроскопически. Ферментативную активность рассчитывают по отношению к объему среза или, лучше, к азоту белка.
Свойства отдельных искусственных переносчиков электронов. Метилвиологен (?' = —0,45 В) и бензилвиологен (Е' = —0,36 В) применяются для выявления систем с ярко выраженными восстанавливающими свойствами. Они могут восстанавливаться фотосистемой I хлоропластов, но не фотосистемой II. Восстановленная форма легко окисляется на воздухе (автоокисление), поэтому опыты следует проводить в анаэробных условиях.
Тетразолйевые красители растворимы в воде и практически бесцветны, но при восстановлении большинство из них дает интенсивное красное окрашивание, обусловленное образованием форма-зана. Поскольку восстановление необратимо, эксперименты можно проводить на воздухе. К сожалению, способность к восстановлению сильно зависит от pH. При низких pH восстановление идет плохо, и может образоваться бесцветный продукт, зато в щелочных условиях восстановление может быть спонтанным. Участок митохондриальной цепи переноса электронов, с которого акцептирует электроны тетразолиевая соль, а также легкость, с которой происходит восстановление, зависят от того, какая именно тетразолиевая соль применяется. Из солей этого рода чаще всего используют хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий {Е' = — 0,08В). Для количественных определений выпавший в осадок формазан растворяют в органическом растворителе и измеряют интенсивность окраски.
’Метиленовый синий (?' = +0,01 В) также применяется для определения скорости переноса электронов, однако пользоваться
234 Часть III. Аналитические методы
им неудобно, поскольку краситель самоокисляется, и эксперименты нужно проводить анаэробно. То же самое справедливо и для фена-зинметосульфата (ФМС, Е' = +0,08 В). Скорость ферментативной реакции, определяемая с помощью ФМС, сильно зависит от концентрации красителя. При очень высоких концентрациях краситель может оказывать ингибирующее действие. Другая трудность связана со светочувствительностью красителя, а также с не очень высокой его специфичностью — по-видимому, ФМС может взаимодействовать с двумя участками цепи переноса электронов в митохондриях.
2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИ, Е' = +0,22 В) подвержен самоокислению лишь в незначительной степени и удобен в том отношении, что эксперименты с ним можно проводить аэробно, однако окраска его зависит от pH. При pH 4 и ниже это соединение имеет красный цвет, а при более высоких значениях pH— синий. Данный краситель применяется в основном для работы с хлоро-пластами при изучении реакции Хилла. Хлоропласты суспендируют в подходящей среде, добавляют ДХФИ и раствор освещают. При высвобождении электронов из молекул воды образуется кислород, а электроны по цепи переноса передаются на краситель, который восстанавливается и становится бесцветным. Скорость переноса электронов в хлоропластах определяют спектроскопически, наблюдая за ходом восстановления красителя.
Феррицианид калия (?¦' = +0,36 В) применяется для изучения переноса электронов как в митохондриях, так и в хлоропластах, а также для определения активности изолированных дегидрогеназ. Он взаимодействует с дыхательной цепью митохондрий в двух участках.
Искусственные доноры электронов. Восстановленная форма окислительно-восстановительной пары может выступать в качестве донора электронов. Так, например, в хлоропластах ионы марганца (параМп2+/Мп3+) могут окисляться, заменяя тем самым воду. В качестве искусственного донора электронов наиболее широко применяется аскорбиновая кислота, обычно в смеси с другими веществами. Например, при работе с хлоропластами было показано, что в фотосистеме 11 аскорбиновая кислота в чистом виде или в смеси с фе-нилендиамином может подвергаться окислению вместо воды. Та же аскорбиновая кислота в сочетании с ДХФИ является донором электронов для фотосистемы I. При работе с митохондриями аскорбиновую кислоту часто применяют в сочетании с цитохромом с или с Ы,Ы,№,Ы'-тетраметил-р-фенилендиамином (ТМФД): в обоих
случаях электроны передаются на цитохром с.
Гл. 7. Потенциометрия, электрометрия и полярография 235
7.7. Полярография
Полярографический метод основан на автоматической регистрации силы тока при постепенном увеличении напряжения на электродах, погруженных в исследуемый раствор. По определению одним из этих электродов является капельный ртутный электрод. Более общим описательным названием данного метода является термин «вольтаметрия»; в этом случае имеется в виду, что запись показаний силы тока и напряжения может осуществляться вручную, а вместо капельного ртутного электрода применяется платиновый.
