Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
7.6.1. Потенциометрическое титрование
окислительно-восстановительных реакций
Окисляя восстановленную форму окислительно-восстановительной пары окисляющим агентом и включив в цепь электрод сравнения, можно определить возникающую при этом разность потенциалов. Зависимость разности потенциалов от процентного содержания окисленной формы представляют графически (рис. 7.7, а). Аналогичным образом, проводя титрование окисленной формы той же самой пары восстанавливающим агентом, получают график зависимости разности потенциалов от процентного содержания восстановленной формы (рис. 7.7, б). Одна из этих кривых является зеркальным отображением другой. Конкретная форма кривой зависит от того, какой переход — одно- или двухэлектронный — имеет место (кривые I ¦— одноэлектронный переход, кривые II — двухэлектронный переход). Иногда два электрона передаются по-
Гл. 7. Потенциометрия, электрометрия и полярография 231
Ошжнная форма, % а
Восстановленная форма, %
6
Рис. 7.7. Кривые потенциометрического титрования: окисление восстановленной формы (а) и восстановление окисленной формы (б).
/ _ одноэлектронный переход; II — двухэлектронный переход.
следовательно, в два этапа. Это относится к хинонам, для которых характерны промежуточные стабильные формы, называемые сем ихинонами.
Конечная точка окислительно-восстановительного титрования, как правило, обозначается резким скачком электродного потенциала (разности потенциалов). Если, например, титровать сульфат железа перманганатом калия в разбавленной серной кислоте, то вплоть до полного окисления соли окислительно-восстановительный потенциал будет возрастать медленно, а затем последует скачок. При изучении окислительно-восстановительных процессов в биологических системах часто пользуются методикой, при которой образец помещают в буфер, содержащий заданную смесь ферро-и феррицианидов калия. Нередко процентное содержание восстановленной формы в образце, например для цитохромов, определяют спектроскопическими методами, что, строгр говоря, не является титрованием.
232 Часть HI. Аналитические методы
7.6.2. Окислительно-восстановительные индикаторы
Большинство таких индикаторов ярко окрашены в окисленном состоянии и бесцветны в восстановленном (хотя имеются и исключения, такие как соли тетразолия и виологены). Эти индикаторы можно применять для определения окислительно-восстановительного потенциала отдельного раствора, а также исполщрвать в качестве доноров или акцепторов электронов, причем в этом случае можно следить за скоростью реакции окисления или восстановления. По скорости восстановления красителя, наблюдая за окраской раствора, определяют также ферментативную активность (например, сукцийатдегидрогеназы). Применение индикаторов дает возможность изучать процессы переноса электронов в хлоропластах, митохондриях, бактериальных и дрожжевых клетках и даже в тканевых срезах и гомогенатах. Для определения степени окисленности или восстановленное™ обычно применяют спектрофотометрические методы, хотя можно следить и за поглощением или выделением газа, если оно имеет место в процессе реакции.
Если акцептор электронов после его восстановления вновь легко окисляется (например, метиленовый синий), измерения необходимо проводить в анаэробных условиях, иначе снова появится исходная окраска. Это удобно делать в пробирках Тунберга. Каждый отдельный краситель можно использовать только в узком диапазоне значений окислительных потенциалов. Так, уменьшение степени окисленности от 99% до 1% в одноэлектронной системе вызывает изменение потенциала на 0,24 В, а в двухэлектронной — всего на
0,12 В. Подбирая соответствующие сочетания красителей, можно, однако, расширить область измерений.
Желательно, чтобы окраска индикатора не зависела от изменения pH, но это далеко не всегда возможно. pH оказывает заметное влияние на окислительно-восстановительные потенциалы пар, у которых ионы водрода являются участниками реакции. Следовательно, необходимо указывать pH, при котором получена величина
Eh-
Полученные результаты необходимо трактовать с осторожностью, поскольку красители могут влиять на происходящие реакции, а также ингибировать ферменты или отравлять микроорганизмы. Важно учитывать и проницаемость — краситель может не попасть в ту часть клетки, где протекает ферментативная реакция.
Применимость красителя в качестве искусственного донора или акцептора электронов зависит от скорости, с которой он взаимодействует с соответствующими компонентами биологической системы, и от степени специфичности этого взаимодействия. К сожалению, многие красители не являются высокоспецифичными и могут отдавать или принимать электроны в нескольких звеньях цепи переноса в зависимости от условий (например, концентрации красителя).
Гл. 7. Потенциометрия, электрометрия и полярография 233
В таких случаях иногда применяют эти соединения в сочетании с ингибиторами, что позволяет изолированно изучать одно из звеньев цепи. При этом электроны искусственно вводятся в какое-либо одно место цепи и искусственно удаляются из нее в другом месте.
