Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
100
тельным стандартным отклонением аотн = .у—-. Итак, чем боль-
V п
ше число импульсов п, тем меньше а, поэтому для измерения радиоактивности с выбранным отклонением а0 можно просто набрать в одном счете такое число импульсов п0, что а0 = Vn0.
Обычно опыты с радиоактивностью проводят так, чтобы <хотн =
= 1%. Для этого п должно быть не менее 10 ООО
("W"= 1 % ) '
Это означает, что при однократном счете с вероятностью 68,3% истинное значение числа импульсов равно 10000 ± 100. Для получения более высокой точности надо набрать больше импульсов, и, наоборот, меньшее число импульсов дает худшую точность. Следовательно, если мы хотим, чтобы все образцы серии были просчитаны с одинаковой точностью, нужно набрать одинаковое число импульсов.
6.4. Преимущества применения радиоактивной метки
Основное преимущество методов с1 применением радиоизотоц-ных меток перед другими физическими и химическими методами — их чувствительность. Например, удельная радиоактивность чистого трития около 50 Ки-мМ-1, и этот изотоп можно разбавлять в 1012 раз, не опасаясь, что радиоактивность не удастся обнаружить. Применение радиоактивных меток позволяет обнаруживать вещества, присутствующие в клетках в таких малых количествах, когда любой чувствительный химический метод здесь бессилен. Другое преимущество радиоактивных меток состоит в том, что их можно вводить в живой организм и проводить исследования с их помощью на уровне интактного организма, что очень выделяет этот метод среди других.
Несмотря на перечисленные преимущества, метод с применением радиоактивной метки, как и всякий метод, имеет некоторые огра-
208 Часть III. Аналитические методы
ничения. Во-первых, хотя меченые соединения'участвуют в тех же биохимических реакциях, что и соответствующие немеченые, скорость таких реакций с участием изотопов может быть другой, чем для обычных содинений. Это так наываемый изотопный эффект. Различия в скоростях химических реакций пропорциональны разности масс изотопов. Так, самая большая разница — у изотопов водорода *Н и 3Н, меньше у 12С и 14С и совсем незначительна у 31Р и 32Р. Во-вторых, количество изотопа в исследуемом объекте должно бы быть минимально необходимым для хорошей регистрации, иначе излучение может сказаться на организме, нарушить его функционирование, а следовательно, привести к неверным результатам. И, наконец, следует иметь в виду, что при введении соединения уровень его в организме становится выше нормального; поэтому к получаемым результатам всегда надо относиться критически.
6.5. Применение радиоизотопов
в биологических исследованиях
Ниже рассмотрена область применения радиоизотопов в биологии1. Поскольку число возможных приложений очень велико, а экспериментальные детали довольно сложны, мы даем просто краткий обзор этих приложений.
6.5.1. Исследование путей метаболизма
Радиоизотопы часто применяются для выяснения путей метаболизма различных соединений. Эти исследования обычно проводят по следующей схеме. Сначала добавляют меченое соединение, затем в различные моменты времени извлекают пробы, экстрагируют из них продукты и проводят их хроматографический анализ. Радиоактивность определяют либо сканированием хроматограмм счетчиком Гейгера, либо авторадиографически, выдерживая хроматограммы в контакте с рентгеновской пленкой в течение некоторого времени. Идентифицировав меченые соединения, определив в каждом из них радиоактивность, построив соответствующие графики, можно получить информацию о реакциях, участвующих в метаболизме.
С использованием радиоактивных соединений можно проверить ту или иную гипотезу о путях метаболизма соединений. Например, можно предсказать судьбу отдельных атомов углерода 14С-ацетата в цикле трикарбоновых кислот. Были разработаны методы выделения промежуточных продуктов цикла, которые позволили получить данные по распределению углерода в каждом промежуточном продукте. Этот способ называется специфическим течением. Совпаде-
Гл. 6. Радиоизотопные методы 209
ние полученных данных с предполагаемой моделью является доказательством правильности модели.
Другой пример применения радиоизотопов — установление последовательности работы ферментов при окислении глюкозы. Существует несколько возможных путей окисления глюкозы. В аэробных организмах их два: гликолиз с циклом трикарбоновых кислот и пентозо-фосфатный. Зачастую в организме и соответствующих тканях присутствуют ферменты для обоих типов метаболизма, и интересно выяснить роль каждого из них. Оба пути приводят к полному окислению глюкозы до двуокиси углерода, но шесть атомов углерода глюкозы принимают участие в ее образовании в разной степени (по крайней мере на начальных стадиях превращения экзогенно добавленного субстрата). Поэтому можно выявить двуокись углерода, образовавшуюся при окислении специфически меченой глюкозы (например, 14С-глюкозы, в которой радиоактивный изотоп 14С содержит только Св-атом глюкозы), и выяснить участие каждого из метаболических путей в процессе окисления.
