Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Ионизация молекул белка качественно напоминает ионизацию аминокислот, но в количественном отношении отличается от нее благодаря наличию большого числа способных к ионизации групп. Белки образуются путем конденсации а-аминогруппы одной аминокислоты с о-карбоксильной группой соседней аминокислоты, поэтому, за исключением двух концевых аминокислот, все а-амино-и карбоксильные группы участвуют в образовании пептидных связей и в белке не ионизуются. Однако в боковых цепях присутствуют сотни амино- и карбоксильных групп, которые могут легко ионизоваться. Электростатическое притяжение, возникающее между некоторыми из этих групп, способствует стабилизации третичной структуры белковой молекулы, при этом молекулы белков часто бывают свернуты таким образом, что большинство способных к ионизации групп оказываются расположенными на поверхности молекулы, где они могут вступать во взаимодействие с окружающей средой. Естественно, что относительное число положительно и отрицательно заряженных групп в молекуле белка определяет те или иные ее физические свойства. У гистонов преобладают катионные группы, в то время как в других белках количество анионных и ка-
24 Часть I. Общие вопросы
тионных групп либо одинаково, либо, напротив, преобладают анионные группы.
В отличие от аминокислот у белков изоионная точка обычно не совпадает с изоэлектрической. По определению изоионная точка — это такая величина pH, при которой молекула белка содержит равное число положительно и отрицательно заряженных групп, образовавшихся в результате связывания основных групп с лрото-нами и соответствующей диссоциации кислотных групп. Изоэлект-рическая точка — это pH, при котором белок электрофоретически неподвижен. При ее определении белок растворяют в буферном растворе. В этом растворе всегда содержатся низкомолекулярные анионы и катионы, способные связываться с многочисленными заряженными группами белка. В таких условиях наблюдаемое в изоэлектрической точке равновесие зарядов частично обусловлено их компенсацией связавшимися с молекулой белка анионами и катионами.
Молекулы белка всегда изучают в буферных растворах; при этом важно установить изоэлектрическую точку, поскольку, например, именно при этом значении pH создаются наиболее благоприятные условия для взаимодействия между противоположно заряженными группами соседних молекул, что ведет к их последующей агрегации и быстрому осаждению.
Агрегацию, а следовательно, и осаждение белковых молекул можно вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок — белок начинают преобладать над взаимодействиями белок — вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза.
1.3. Подходы к биохимическому исследованию
Как мы уже говорили, активность клетки зависит от взаимодействия ее как с непосредственным окружением, так и с клетками, значительно удаленными от нее; кроме того, играет роль также и то, какие метода применяются для ее изучения. Поэтому чтобы получить наиболее полное представление о состоянии клеток внутри органов и тканей, опыты лучше всего проводить на интактных изолированных органах и тканях. Преимущество такого изучения заключается в том, что нри этом удается избежать нежелательных эффектов, обусловленных изменением непосредственного тканевого окружения, как это имеет место, например, при фракционировании
Уровни
исследования
Целое
животное
Орган
ГЬмогвнат
Органелла
или
частица
Молекулярный
¦электронный
Атомный и злектронный
Действие*
ЦЕЛОЕ
ЖИВОТНОЕ
-Распределение
'физиология
фармакология
эндокринология
микробиология
иммунология
вирусология
>кализац органа
[Извлечение
ИЗОЛИРОВАННЫЙ
ОРГАН
^Гомоеенизацш
ЭКЗОГЕННОЕ ГОМОГЕНАТ
СОЕДИНЕНИЕ ОРГАНА
^ целого организма
^оксикологи&^\Мечвное щ-Токсич- Jгистология \ мзотопом ноет!, ^тератология \ \соединение
\патоморфология\ N.
Биологические Выведение метаболитов
\Премаративное
ОРГАНЕМЫИЛИ ЧАСТИ-ЦЫ(МИКРОСОМЫ) ---------г
Разделение
ЦИТОХРОМЫ Р450 И bs, ЦИТОХРОМ-С-РЕДУКТЛЗЛ, БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ НЕГЕМИНОВОЕ ЖЕЛЕЗО, \НАДФ-Н, 61______________________________
