Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Буферным называется такой раствор, который препятствует изменению концентрации ионов водорода при добавлении к нему кислоты или щелочи. Такое действие раствора называется буферным. Величину буферного действия характеризуют буферной емкостью р, равной количеству сильного основания, которое необходимо добавить для изменения pH раствора на одну единицу.
d (pH) ’
где d(pH) — изменение pH раствора при добавлении dfc .основания.
Обычно пользуются буферными растворами, состоящими из смеси слабой кислоты или основания и соли этой кислоты, например смеси уксусной кислоты и ацетата натрия (по номенклатуре
20 Часть I. Общие вопросы
Брёнстеда и Лоури буферный раствор представляет собой смесь слабой кислоты и сопряженного с ней основания).
При добавлении к раствору слабой кислоты (НА) и ее соли (А~) ионов водорода последние нейтрализуются анионами соли, которые действуют в данном случае как слабое основание; гидроксильные ионы, наоборот, нейтрализуются кислотой. Отсюда следует, что буферная емкость раствора, составленного из данной кислоты и сопряженного с ней основания, максимальна в том случае, когда их концентрации равны, т. е. pH = рКа кислоты. Буферная емкость зависит также от общей концентрации раствора и отношения соль— кислота: чем выше концентрация раствора, тем больше его буферная емкость. Концентрация кислоты и соли в буферных растворах обычно бывает порядка 0,05—0,20 М, а достаточной буферной емкостью растворы обладают в области значений pH = рКа ± 1 •
Буферы, применяемые для биологических исследований, должны удовлетворять ряду требований: .
1. Обладать достаточной буферной емкостью в требуемом диапазоне значений pH.
2. Обладать высокой степенью чистоты.
3. Хорошо растворяться в воде и не проникать через биологические мембраны.
4. Обладать устойчивостью к действию ферментов и гидролизу.
5. pH буферных растворов должен как можно меньше зависеть от их концентрации, температуры и ионного или солевого состава среды.
6. Не оказывать токсического или ингибирующего действия.
7. Комплексы буфера с катионами должны быть растворимыми.
8. Не поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра.
К сожалению, этим требованиям удовлетворяют далеко не все буферные растворы. Так, фосфаты обладают способностью осаждать поливалентные катионы и во многих системах выступают'в качестве метаболитов или ингибиторов; трис-буфер иногда оказывает токсическое или ингибирующее действие. До недавнего времени насчитывалось всего несколько буферов, pH которых лежит в важной для биохимии области 6,0—8,0 и которые удовлетворяют перечисленным выше требованиям. В последние годы, однако, появился целый ряд так называемых цвиттерионных буферов типа ГЭПЭС и ПИПЭС. Некоторые наиболее распространенные буферы приведены в табл. 1.1. Для получения буферных растворов, применимых в широком диапазоне значений pH, используются смеси разных буферов. Например, буферы Мак-Ильвейна имеют pH с областью значений от 2,2 до 8,0 и приготавливаются из лимонной кислоты и двузамещенного фосфорнокислого натрия.
Наиболее важной группой физиологических буферов являются белки. Благодаря большому количеству содержащихся в боковых
Гл. 1. Общие принципы биохимического исследования 21
цепях аминокислот щелочных и слабокислых групп белки имеют очень высокую буферную емкость. Буферная емкость крови в основном определяется гемоглобином.
1.2.3. Зависимость ионизации аминокислот и белков от pH
Аминокислоты и белки — это наиболее важные в биологическом отношении соединения, поэтому необходимо знать, в какой степени изменение pH влияет на их физические свойства. За исключением пролина, химические формулы всех аминокислот, из которых синтезируются белки, можно записать в общем ' виде как RCH(NH2)COOH. рКа аминогруппы лежит в области 9,0—10,5, а карбоксильной группы — между 1,7 и 2,4.
Степень ионизации аминокислот в водных растворах зависит от pH и определяется уравнением Гендерсона—Хассельбальха.
Таблица 1.1
Значения рКа некоторых соединений, являющихся главными комповентамн буферных растворов
Кислота или основание рКа (при 25*С)
Уксусная кислота............... 4,75
Барбитуровая кислота ............. 3,98
Угольная кислота ...... ......... 6,10; 10,22
Лимонная кислота............... 3,10; 4,76; 5,40
Глицилглицин ................. 3,06; 8,13
ГЭПЭС1.................... 7,50
1,96; 6,70; 12,30
ПИПЭС».................... 6,80
Фталевая кислота............... 2,90; 5,51
Янтарная кислота............... 4,18; 5,56
Винная кислота................ 2,96; 4,16
8,14
* ГЭПЭС — N-2-оксиэтн л пиперазин-N'-2-этансульфоно*ая кислота.
* ПИПЭС — пиперазин-Ы-Ы'-ди(2-этансульфоновая кислота).
