Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
3.2.3. Тонкослойная хроматография (ТСХ)
Этот метод особенно успешно применяется для разделения очень малых количеств материала. В своей основе он сходен с колоночной хроматографией; иными словами, тонкослойная хроматография — это по своей сути адсорбционная хроматография, хотя в первом случае могут играть роль и процессы распределения. При ТСХ слой адсорбента наносят на стеклянные пластинки. В отличие от колоночной хроматографии применяемые в ТСХ адсорбенты содержат связывающие агенты, например сернокислый кальций, что способствует лучшей фиксации их на стеклянной пластинке. Адсорбент наносят на пластинки в виде кашицеобразной суспензии; нанесение начинают с одного конца,постепенно переходя к другому; затем пластинки высушивают в сушильном шкафу при температуре 100—120°С. После испарения воды на пластинках остается тонкий слой адсорбента. Для одновременного покрытия ровным слоем суспензии адсорбента большого количества пластинок пользуются специальными аппликаторами. При проведении качественного анализа суспензию наносят слоем толщиной в 0,25 мм; в препаративной ТСХ толщина слоя достигает 5 мм. В табл. 3.2 приводится перечень адсорбентов, которые обычно применяются при ТСХ.
Пробу в виде пятна наносят на пластинку при помощи микропипетки или шприца на расстоянии приблизительно 2,5 см от нижнего края пластинки и примерно на таком же расстоянии от одной из боковых сторон. Затем пробы подсушивают (чаще всего с помощью вентилятора) для удаления растворителя, чтобы на это же место можно было повторно наносить новые порции. Все пятна следует
Гл. 3. Хроматографические методы 71
Таблица 3.2
Адсорбенты, применяющиеся в тонкослойной хроматографии
Адсорбент Исследуемые соединения
Силикагель Аминокислоты, алкалоиды, сахара, жирные кис
лоты, липиды, эфирные масла, неорганические
анионы н катионы, стероиды, терпеноиды
Окись алюмнння Алкалоиды, пищевые красители, фенолы, стерои
ды, витамины, каротины, аминокислоты
Кизельгур Сахара, олигосахариды, двухосновные кислоты,
жирные кислоты, триглицериды, аминокислоты,
стероиды
Целит Стероиды
Целлюлозный порошок Аминокислоты, пищевые красители, алкалоиды,
нуклеотиды
Ионообменная целлюлоза Нуклеотиды
Крахмал Аминокислоты
Сефадекс Аминокислоты, белки
наносить на одном и том же расстоянии от кромки пластинки и тщательно следить за тем, чтобы слой адсорбента в месте нанесения пробы не нарушался.
Разделение проводят в стеклянной камере. На дно ее наливают растворитель слоем толщиной 1,5 см, затем закрывают стеклянной крышкой и оставляют на 1 ч для насыщения камеры парами растворителя (уравновешивание). Если этого не сделать, то растворитель, поднимаясь вверх по пластинке, будет испаряться, что отразится яа качестве разделения. После достижения равновесия снимают крышку и помещают в камеру хроматографическую пластинку. Ее устанавливают вертикально так, чтобы место нанесения пробы было несколько выше уровня растворителя. Затем камеру снова накрывают крышкой; растворитель поднимается вверх по пластинке и таким образом происходит разделение. Температура в камере в ходе всего процесса разделения должна быть постоянной.
Эффективность разделения можно повысить с помощью двухмерной хроматографии. В этом случае пробу наносят в виде отдельного пятна в нижний угол пластинки и проводят разделение в одном направлении. Затем пластинку вынимают из камеры и высушивают, после чего хроматографируют в другой системе растворителей в направлении, перпендикулярном первому (рис. 3.3).
Многие фирменные адсорбенты для ТСХ содержат флуоресцирующие красители; после разделения пластинки просматривают в ультрафиолетовом свете, и отдельные компоненты выявляются на них в виде синих, зеленых или темных пятен. Эти пятна отмечают, соскабливают, а затем элюируют соответствующее соединение при помощи растворителя, вымывающего это соединение, но не раствр-
72 Часть II. Методы разделения
Направление первого разделения
I
©
х Точка старта
Рис. 3.3. Двухмерная хроматограмма.
ряющего краситель. Это особенно важно в тех случаях, когда разделяемые компоненты нужно исследовать дальше и определять их количество.
Если адсорбенты не содержат красителей, то положение соединений на пластинке определяют другими методами. При опрыскивании пластинок 50%-ным раствором серной кислоты и последующем их нагревании большинство соединений обугливается, в результате чего на пластинках в соответствующих местах проявляются коричневые пятна. Флуоресцирующие или поглощающие ультрафиолетовый свет соединения можно обнаружить, просматривая пластинки в УФ-свете. Ненасыщенные соединения хорошо окрашиваются в присутствии паров иода- Опрыскивание пластинок особыми красящими агентами вызывает окрашивание определенных соединений: так, например, нингидрин применяется для идентификации аминокислот. Действие большинства таких красителей основано на специфических количественных цветных реакциях (разд. 5.3.2). При разделении радиоактивных веществ можно получать авторадиограммы пластинок; местоположения компонентов определяют по темным пятнам на рентгеновской пленке. ИнЪгда пластинки просчитывают на счетчиках при помощи специальных сканирующих устройств.
