Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
т
Стадии 3
т
т
'.V.
;0?
т.
т
Ш;.
Ш-
Ч?
3*
68 Часть II. Методы разделения
Рис. 3.2. Зависимость профиля элюции от числа теоретических тарелок п.
тарелок. Этим термином обычно пользуются для обозначения эффективности Дистил-ляционных колонок; в хроматографии оно выражает число уравновешиваний. Чем выше эффективность колонки, тем больше число теоретических тарелок. На рис. 3.2 изображена зависимость профиля элюции вещества с эффективным коэффициентом распределения, равным 1, от числа теоретических тарелок п.
. 3.2. Адсорбционная хроматография
3.2.1. Принцип метода
Адсорбционная хроматография впервые была использована Цветом для разделения окрашенных веществ. В общепринятом смысле адсорбент — это твердое вещество, способное удерживать на своей поверхности молекулы; эта способность особенно ярко выражена в тех случаях, если поверхность адсорбента содержит большое количество мелких пор. В отличие от ионообменных смол (см. разд. 3.6.1), притяжение молекул к поверхности адсорбента в идеальных условиях не является электростатическим. Сорбция веществ может быть специфической, что позволяет избирательно адсорбировать одно вещество из смеси. В основе разделения методом адсорбционной хроматографии лежат различия в степени адсорбции данных веществ адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе. Эти свойства определяются в основном молекулярной структурой соединения.
3.2.2. Хроматография на колонке
Колонка для адсорбционной хроматографии представляет собой стеклянную трубку, заполненную адсорбентом. На колонку наносят подлежащую разделению смесь веществ, а затем пропускают через нее растворитель (или смесь растворителей). Разделение основано на том, что вещества с более высоким эффективным коэффициентом распределения продвигаются по колонке с большей скоростью, отделяясь таким образом от веществ с более низким коэффициентом. Если исследуемые соединения окрашены, то при разделении можно
Распределение вещества на колонке
Гл. 3. Хроматографические методы 69
видеть движение по колонке окрашенных полос. Образующиеся в результате разделения зоны извлекают одним из двух способов. Колонку высушивают, окрашенные полосы вырезают, а затем элюируют из зон разделенный материал. Другой способ заключается в том, что растворитель пропускают через колонку до тех пор, пока не соберут все фракции по мере их выхода. Этот метод более пригоден, поскольку при соприкосновении с воздухом, как это имеет место в первом случае, адсорбированный материал может разлагаться.
Как правило, разделяемые с помощью хроматографии на колонке вещества не окрашены; в этом случае весь выходящий из колонки материал собирают в виде фракций, а затем анализируют их. В большинстве случаев вымывание осуществляется за счет увеличения полярности растворителя (градиентная эл'юция, разд. 3.10.5). Некоторые компоненты образца элюируют в исходном растворителе; для удаления более прочно связанных веществ применяют более полярные растворители. Если разделяемые соединения в растворе большей полярности растворяются лучше, эффективный коэффици-
Таблица 3.1
_______Некоторые растворители в порядке возрастания их полярности_____
Растворитель
.Диэлектрическая постоянная при 25°С
Гексан ....................
Гептан ....................
Циклогексан................
1,4-диоксан................
Тетрахлорметан ............
Бензол ....................
Толуол ....................
Ацетонитрил................
Диэтиловый эфир . . •. .
Хлороформ .................
Муравьиная кислота . . . Изоамиловый спирт . . .
Этилацетат ................
Ледяная уксусная кислота Тетрагидрофуран . . . .
Дихлорметан ...............
гпре/п-Бутанол...........:
Пиридин ...................
Бутанол ...................
Изобутанол ................
н-Бутанол..................
2-пропанол ................
1 -пропанол ...............
Ацетон ....................
Этанол ....................
Метанол....................
1,89
1,92
2,02
2,21
2,24
2,28
2,38
3,88
4,34
4,87
5,0
5,82
6,02
6,15
7,58
9,14
10,9
12.3 15,8
17.7
17.8
18.3 20,1 20,7
24.3 33,6
70 Часть II. Методы разделения
ент распределения повышается (разд. 3.1). В табл. 3.1 приведен перечень растворителей в порядке увеличения их полярности (диэлектрической постоянной).
Эффективность разделения чрезвычайно сильно зависит от правильного заполнения колонки адсорбентом (разд. 3.10.2). Обычно применяемые адсорбенты — кремниевая кислота, окись алюминия, карбонат кальция, карбонат цинка и окись магния; выбор адсорбента и системы растворителей для элюции диктуется задачами конкретного анализа. При выборе адсорбентов следует иметь в виду, что некоторые из них в процессе разделения оказывают разрушающее действие на определенные соединения. Другие адсорбенты при хранении поглощают из атмосферы воду, что отрицательно сказывается на их адсорбционных свойствах. В таких случаях, для того чтобы удалить воду и активировать адсорбент, его прогревают в течение некоторого времени при температуре 110°С. Зачастую из-за присутствия в адсорбенте воды разделение, напротив, становится более эффективным, что объясняется участием в процессе как сорбции, так и распределения вещества между разными фазами.
