Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Уильямс Б. -> "Методы практической биохимии" -> 26

Методы практической биохимии - Уильямс Б.

Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии — М.: Мир, 1978. — 273 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiprakticheskoybiohimii1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 112 >> Следующая

66 Часть II. Методы разделения
другими словами, это есть произведение коэффициента распределения вещества и отношения объемов обеих фаз. Пусть коэффициент распределения данного вещества между двумя растворителями I и II равен единице; тогда, если вещество уравновешивается между 10 см3 первого растворителя и I см3 второго, его концентрация в обеих фазах будет одинаковой, однако общее количество вещества в растворителе I будет в 10 раз превышать его количество в растворителе II.
Все хроматографические системы состоят, как правило, из двух фаз. Одной из них является неподвижная фаза, которая бывает твердой, жидкой или представляет собой смесь твердой и жидкой фаз. Вторая, подвижная фаза* может быть жидкой или газообразной; она обычно течет по неподвижной фазе или пропускается через нее. Фазы для хроматографического разделения выбирают так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси в них были различными. Разделение может происходить за счет установления:
а) адсорбционного равновесия между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами (адсорбционная хроматография)-,
б) равновесного распределения между неподвижной жидкой (или полужидкой) и подвижной жидкой фазами (противоточное распределение и хроматография на бумаге)-,
в) равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной газовой фазами (газожидкостная хроматография)',
г) ионообменного равновесия между ионообменной смолой (неподвижная фаза) и электролитом (подвижная фаза) (ионообменная хроматография).
д) равновесия между жидкой фазой на внутренней и внешней поверхностях пористой структуры или «молекулярного сита» (проникающая хроматография)',
е) равновесного связывания макромолекулы с малой молекулой, по отношению к которой она проявляет высокую биологическую специфичность, а следовательно, и сродство (аффинная хроматография).
Принцип, на котором основано разделение, легко понять на примере работы стеклянной хроматографической колонки. Пусть колонка заполнена на высоту 5 см твердой гранулированной неподвижной фазой, окруженной подвижной жидкой фазой (1 см3 на 1 см высоты колонки) (рис. 3.1). Если внести в верхнюю часть колонки 1 см3 растворителя, содержащего, например» 32 мкг анализируемого вещества, то этот объем по мере продвижения его по колонке займет положение А, а равный объем растворителя (1 см3) выйдет из колонки. Если эффективный коэффициент распределения вещества равен единице, то оно распределится между твердой и жидкой фазами равномерно. При добавлении нового объема (1 см3) растворителя объем, находившийся в положении А, перейдет в положение Б, увлекая за собой 16 мкг анализируемого вещества;
Гл. 3. Хроматографические методы 67
Рис. 3.1. Схема разделения ве- Стадии
ществ с помощью хроматографии
на колонке. 12 3 4 5
(?
¦ а Щ ш ш ш ш
Б
остальные 16 мкг останутся в в ___ -!?;:
положении А. В обоих поло- Г
жениях, А и Б, вещество пе- — — —
рераспределится таким обра- Д Щ]
зом, что 8 мкг его перейдут в
растворитель, а остальные
8 мкг будут находиться в
твердой фазе. Добавление
еще одной порции растворителя (1 см3) вызовет перемещение объема, находившегося в положении А, в положение Б, из которого раствор переместится соответственно в положение В, в результате чего вещество распределится так, как это показано на стадии 3. Распределение вещества после последовательного добавления двух новых порций растворителя (каждая по 1 см3) показано в положениях 4 и 5.
Очевидно, что после пяти добавлений растворителя (уравновешиваний) исследуемое вещество распределится по всему объему колонки, причем его концентрация будет максимальна в середине колонки. Если эффективный коэффициент распределения вещества меньше единицы, то после каждого уравновешивания в твердой фазе будет оставаться более 50% вещества. Пик концентрации будет расположен несколько выше середины колонки, хотя некоторая часть исследуемого вещества распределится по всему объему. И наоборот, если эффективный коэффициент распределения вещества больше единицы, пик концентрации будет находиться ниже середины колонки.
Чем больше число уравновешиваний, тем выше концентрация вещества в определенной части колонки; таким образом, характер распределения смеси веществ зависит в основном от двух факторов: коэффициента распределения и числа уравновешиваний. Скорость прохождения соединения через колонку определяется величиной эффективного коэффициента распределения данного соединения, а форма образующегося пика зависит от числа проведенных уравновешиваний.
Поскольку растворитель добавляется в колонку непрерывно, в действительности процесс установления равновесия происходит постоянно. Число уравновешиваний, как правило, исчисляется тысячами и определяется так называемым числом теоретических
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 112 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed