Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
2.9.2. Оценка чистоты препаратов
Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации: гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча; они же обусловливают асимметрию основного пика.
2.9.3. Исследование конформационных изменений в макромолекулах
Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования — исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений (таких, например, как органические растворители) или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Чем компактнее молекула, тем меньше ее коэффициент трения в растворе и наоборот: чем менее она компактна, тем больше коэффициент трения и, следовательно, тем медленнее будет она седиментировать. Таким образом, различия в скорости седиментации образца до .и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конфор-мационные изменения, происходящие в макромолекулах.
У аллостерических белков, таких, например, как аспартат-транскарбамоилаза, конформационные изменения возникают в результате связывания их с субстратом и (или) малыми лиганДами (активаторами или ингибиторами). Диссоциацию белка на субъеди-.
64 Часть II. Методы разделения
ницы (протомеры) можно вызывать, обработав его такими веществами, как мочевина или парахлормеркурибензоат. Все эти изменения легко можно проследить при помощи аналитического ультрацентрифугирования.
2.10. Рекомендуемая литература
Allfrey V., Isolation of subcellu.lar components. In the Cell. Vol. I. Ed. by Braehet, J. and Mirsky, A. E. Academic Press, London, 1959. (Обзор существующих методов разделения субклеточных компонентов.)
Bowen Т. Ап Introduction to Ultracentrifugation. Wiley-Interscience, John Wiley, London, 1970. (Введение в ультрацентрифугирование.) DeDuve С., General principles. In Enzyme Cytology. Ed. by Roodyn, D. B. Academic Press, London, 1967. (В статье содержится описание общих принципов разделения и последующего анализа субклеточных структур.) *
National Cancer Institute Monograph 21, The Development of Zonal Centrifuges and Ancillary Systems for Tissue Fractionation and Analysis. National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, U.S.A., 1966. (Монография представляет собой фундаментальное исследование, освещающее историю создания зонального ротора и область применения зонального центрифугирования; описаны материалы, применяющиеся для создания градиентов.)
Глава 3
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
3.1. Общие принципы хроматографии
Задача, с которой биохимикам постоянно приходится сталкиваться при исследовании биологических соединений,— это их выделение и очистка. Одним из наиболее удобных методов разделения является хроматографический метод, с помощью которого можно разделять как большие (несколько граммов), так и малые (пикограммы) количества материала. Выбор того или иного вида хроматографии зависит от природы выделяемого материала; зачастую для достижения необходимой степени очистки приходится последовательно применять несколько хроматографических методов. Со времени изобретения хроматографии как аналитического метода исследования появилось множество его модификаций, что значительно расширило область его применения. В последующих разделах дается краткое описание основных видов хроматографии, широко применяющихся в биохимической практике.
Распределение соединения между двумя несмешивающимися фазами определяется коэффициентом распределения. Для конкретного вещества коэффициент распределения его в системе, состоящей из двух растворителей (I и II), является приданной температуре постоянной величиной и выражается следующим отношением:
Концентрация вещества в растворителе I _const
Концентрация вещества в растворителе II
Понятие «распределение вещества» относится к распределению его не только между двумя растворителями, но и между любыми двумя фазами, например твердой и жидкой или газовой и жидкой фазами. Если коэффициент распределения вещества в какой-либо системе, например, кремниевая кислота—бензол, равен 0,5, это значит, что концентрация его в бензоле вдвое выше, чем в кремниевой кислоте. Понятие «коэффициент распределения вещества» является основополагающим в хроматографии. Для удобства нод коэффициентом распределения в данном случае понимают отношение концентрации вещества в подвижной фазе к его концентрации в неподвижной фазе.
Термином эффективный коэффициент распределения обозначают отношение общего количества вещества (в отличие от концентрации) в одной фазе к общему количеству этого вещества в другой фазе; .3—502
