Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
¦Гл. 2. Центрифугирование 55
Образец
Слой раствори- Введение растворителя меныиеи глеля меньшей плот- Расстояние от центра платности ности ^ вращения
Крупные_ частицы
Мелкие'.. .......... ^
частицы :•&
I
Раство-римая
О А В
Расстояние от центра вращения
Вытеснение содержимого ротора
О А В
Расстояние от центра вращения
(с любезного разрешения Measuring and Scientific Equipment Ltd.).
Затем через осевую трубку, наслаивают исследуемый образец (рис. 2.6, в), который вытесняют из трубки в объем ротора с помощью раствора меньшэй плотности (рис. 2.6, г), при этом с периферии удаляется такой же объем «подушки». После всех этих процедур скорость вращения ротора доводят до рабочей и в течение необходимого промежутка времени проводят либо зонально-скоростное, либо зо-нально-изопикническое фракционирование (рис. 2.6, 5). Извлечение фракций проводят при скорости вращения ротора 3000 об - мин-1. Содержимое ротора вытесняют путем добавления с периферии «подушки», в первую очередь вытесняются менее плотные слои (рис. 2.6, е). Благодаря особой конструкции осевого канала ротора Андерсона смешивания зон при их вытеснении не происходит. Выходящий градиент пропускают через регистрирующее устройство, например ячейку спектрофотометра, с помощью которого по погло-
56 Часть II. Методы разделения
щению при 280 нм можно определить содержание белка, или через специальный детектор радиоактивности, после чего собирают фракции.
Емкость зональных роторов, используемых при средних скоростях, варьирует от 650 до 1600 см3, что позволяет получать довольно большое количество материала (до 100 мг). Зональные роторы применяются для удаления белковых примесей из различных препаратов и для выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков.
2.6. Анализ субклеточных фракций
Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства.
Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл: например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы — маркерами лизосом, каталаза — маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза — маркером мембран микросОм. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р-глюкуронидаза, НАДФ- Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органел-лами или он ингибируется или инактивируется; поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров.
Определение ферментативной активности-.
57
Фракция Объем, Общее раз- Экснюк- Единицы Выход
сма ведение ция, активно активно
660 нм сти сти во
фермента фракции,
%
Цельный гомогенат ..... 121 1:35 0,45 515
Ядра ............ 30 1:21,7 0,195 35,2 6,99
Митохондрии ........ 21,5 1:105 0,3 186,3 37
Лизосомы.......... 16,5 1:105 0,34 162 32,17
Микросомы ......... 21 1:27,7 0,41 51,5 10,23
Супернатант......... 287 1:21,7 0,04 68,5 13,61
503,5 100
Определение белка:
Фракция Объем, Общее Экстинк- Белок, Выход белка
см* разведение ция, мг во фракциях,
540 нм %.
