Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Уильямс Б. -> "Методы практической биохимии" -> 18

Методы практической биохимии - Уильямс Б.

Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии — М.: Мир, 1978. — 273 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiprakticheskoybiohimii1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 112 >> Следующая

2.2. Препаративное центрифугирование
2,2.1. Дифференциальное центрифугирование
Этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый (гомогенный) осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса,. происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.
Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно (рис. 2.2, а), поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном (двух- трехкратном) суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.
1
а •
Ья1> •
. >"
<> •
* ао'
• • '
Ч>7
с- ?> bt>f> Р Ь л
•••Г*
•••••
W
ч55у
-(— Растворитель
Мелкие ' частицы
-¦частицы
- Крутые частицы
- Время центрифугирования
Рис. 2.2. Дифференциальное центрифугирование суспензии частиц в центробежном поле.
Сначала частицы распределены по всему объему центрифужной пробирки равномерно (а): в ходе центрифугирования частицы седиментируют в соответствии с их размерами и формой (б — д).
10%-ный (вк/объем)раствор гомогената печени
втме---------------------'—'..........—.'
Центрифугирование при1000»
(Пт)н~Ш).10мин
ОСАДОК
объем 50см3)
-СУПЕРНАТАНТ
Трехкратное промывание вгОсмЧ&Мрастеорк сахарозы
Центрифугирование при ЮООа&^-йсм). Юмин
ОСАДОК ЯДЕР----------------1----------
Объединений
СУПЕРНАТАНТ
ОСАДОК+рьшый слой-----
Трехкратное пршшншп^см* 0,25Мраствора Центрифугирование при3300д(щ№^Всм). Юмин ОСАДОК МИТОХОНДРИЙ+рыхлый схой-
шеприЗЗООд&уг^Йсм). Юмин ¦СУПЕРНАТАНТ
Объединение
СУПЕРНАТАНТ
ОСАДОК
Трехкратное промывание в 20см30,25Мраствора сахаром
Центрифугирование при tS300g(fyedH=8cM), гОмин
ОСАДОК ЛИ30С0М
-СУПЕРНАТАНТ+Рыхмш слой
(гср*дн
tnp,
V), 30мин
-КОНЕЧНЫЙ СУПЕРНАТАНТ
осадок макросом------------
Рис. 2.3. Схема фракционирования гомогената печени крысы на субклеточные фракции.
Гл. 2. Центрифугирование 47
Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже (разд. 2.3.1, 2.3.2 и 2.3.3). Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.
2.2.2. Зонально-скоростное центрифугирование
Метод зонально-скоростного, или, как его еще называют, s-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиен-
ш
Нанесенный
образец
W
'Л1
О
^-Легкие частицы Средние частицы
¦Ткжелые частицы
Рис. 2.4. Скоростное и изопикиическое разделение частиц в градиенте плотности.
Перед началом центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости (а). При скоростном центрифугировании частицы не достигают изопикни-ческой точки, а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуемые частицы не достигнут зоны с соответствующей плотностью (б).
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 112 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed