Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
100 А-10000
щ
.о- г т.
40- -4000 30- '-3000
+ 2000 1500
10+ 1000
Скорость
вращения
ротора,
об/мин
5000-^50000
4500- '-45000 400V. т40000 3500- г35000 3000: г 30 ООО
2500
2000- -20000
1500-1400+. 1300--1200- -1100--1000- -900-800-700-
25000
¦15000
.14000
13000
12000
¦11000
10000
9000
8000
7000 600+6000 500-^-5000
Рис. 2.1. Номограмма для расчета центробежного ускорения.
Для определения О соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах; точка пересечения этой пряной со средней шкалой дает искомую величину центробежного ускорения. Следует иметь в виду, что правая колонка цифр шкалы О соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора; левая —
левой.
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g (гравитационная постоянная, равная 980 см-с-1) и называется относительное центробежное ускорение (ОЦУ), т. е.
рцу_ 4я2 (об-мии-1)2 г _
3600 • 980 ’
ИЛИ
ОЦУ = 1,11 10-* (об-мин-1)2г. (2.1)
При перечислении условий разделения частиц указывают скорость вращения и радиус ротора, а также время центрифугирования. Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g, рассчитанных из среднего радиуса вращения (гсредн) столбика жидкости в центрифужной пробирке (т. е. расстояния от оси вращения до
44 Часть II. Методы разделения
середины столбика жидкости). На основании уравнения (2.1) Доу-лом и Котциасом была составлена номограмма (рис. 2.1), выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г.
Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:
t = —--------5------In -Ь-, (2.2)
2 20)^2 (рч_р) Гы
где t — время седиментации в секундах, rj — вязкость среды, гч— радиус частицы, рч— плотность частицы, р — плотность среды, гн— расстояние от оси вращения до мениска жидкости, гд— расстояние от оси вращения до дна пробирки.
Как следует из уравнения (2.2), при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно разделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирую-щих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды. Описанными методами можно разделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы (или другие микротельца), микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети) и, наконец, рибосомы. Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению (2.2), поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании с помощью ультрацентрифугирования конформации макромолекул (разд. 2.9.3).
Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. При этом можно брать большие количества исходного биологического материала, например посевы микробных клеток из периодических или непрерывных культур, а также посевы растительных и животных клеток из культур ткани и плазмы крови. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое ко-
Гл. 2. Центрифугирование 45
личество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется также для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки из предварительно очищенных препаратов.
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых или практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярном весе и структуре материала. В практикумах для студентов препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем более подробно, хотя в основе обоих методов лежат общие принципы.
