Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Прочие методы. К ним относятся: разрушение клеток методом осмотического шока, переваривание клеточных стенок ферментами, например лизоцимом, и сложными ферментными препаратами, выделенными из улиток и содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Для разрушения клеток некоторых видов успешно применяют замораживание и оттаивание, автолиз и обработку органическими растворителями, такими, как этилацетат и толуол.
Как мы уже говорили, в большинстве случаев разрушение клеток сопровождается выделением тепла. Ввиду того что пр и высоких температурах многие ферменты инактивируются, все процедуры по разрушению клеток и выделению клеточных органелл следует
Гл. 1. Общие принципы биохимического исследования 41
проводить при пониженных температурах. Для этого все работы проводят в холодных комнатах при температуре около 0°С или охлаждают клеточные суспензии с помощью льда. Следует отметить, что некоторые ферменты неустойчивы к холоду и при охлаждении также теряют свою активность.
При гомогенизации разного рода биологических тканей возникает множество частных проблем, которые разрешаются в основном путем проб и ошибок. Достаточную воспроизводимость результатов можно получить лишь при тщательном контроле за такими параметрами, как температура, продолжительность и скорость разрушения клеток, а также применяемое рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенат, который легко поддается дальнейшему фракционированию.
1.11. Рекомендуемая литература
Allfrey V., Isolation of subcellular components. In the Cell, Vol. I. Ed. by Brachet, J. and Mirsky, A. E. Academic Press, London, 1959. (Подробное описание сред суспендирования и методов гомогенизации.)
Bourne G. J., In vivo Techniques in Histology. The Williams & Wilkins Company, Baltimore, 1967. (Подробное описание методов с применением микроэлектродов.)
Dawson R. М. С., Elliot D. С., Elliot W. Н., Jones К- М. (eds), Data for Biochemical Research, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, 1969. (Подробное описание буферных растворов.)
Morris J. G., A Biologist's Physical Chemistry, 2nd edn. Contemporary Biology Series. Edward Arnold, London, 1974. (pH, сила кислот и оснований и буферное действие.)
Paul J., Cell and Tissue Culture, 3rd edn. E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1965. (В книге освещаются все аспекты культивирования растительных и животных тканей.)
Ross В. D., Perfusion Techniques in Biochemistry — a Laboratory Manual. Clarendon Press, Oxford, 1972. (Практическое руководство no использованию метода перфузии и изолированных органов в биохимической практике.)
Staff of the Department of Pharmacology, University of Edinburgh, Pharmacological Experiments in Isolated Preparations, 2nd edn. E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970. (Подробное описание состава физиологических солевых растворов.)
Дополнительная литература
Ленинджер А., Биохимия, пер. с англ., изд-во «Мир», М., 1974.
Диксон М., Уэбб д.. Ферменты, пер. с англ., ИЛ, М., 1961.
Уэбб Л., Ингибиторы ферментов и метаболизма, пер. с англ., изд-во «Мир», М., 1966.
Мешкова Н. П., Физико-химические методы исследования в биологии, изд-во Московского университета, 1975.
Часть II
МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ
В этой части рассмотрены принципы, которые лежат в основе разделения клеточных органелл и частиц (центрифугирование) и способы их очистки (хроматография и электрофорез). Некоторые из этих методов применяются в основном при препаративном разделении, другие с успехом используются в аналитических целях. В приложении даны рекомендации по выбору того или иного метода разделения.
Глава 2
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
2.1. Принцип метода
Разделение веществ с помощью центрифугирования -основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещенную в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.
Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (со, в рад-с"1) и расстоянию между частицей и осью вращения (г, в см):
G = и*г.
Поскольку один оборот ротора составляет 2п радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту (об-мин*1) можно записать так:
2% об ¦ мин-1
а центробежное ускорение тогда будет равной
4я® (об • мин-1)* г
Гл. 2. Центрифугирование 43
Радиус, см 30-г
25-
7-
6-
5-
4-
З-1
Относительное
центробежное
ускорение
7000
6000
5000
4000
3000- -300000
2000
1500
1000
sif-400-
300--
200
150-
15
т
¦500000
¦400000
¦200000
150000
100000
40000 30000
20000 15000
