Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Культуры отдельных частей растения, например корня или меристемы, получают, помещая вырезанные части растения в стерильных условиях в питательную среду, поддерживающую их рост и развитие. В таких средах, которые бывают жидкими или полужидкими, можно выращивать также изолированные растительные и животные клетки. Питательные среды имеют довольно сложный химический состав; как правило, они содержат источник углерода (например, сахар), смесь неорганических солей, микроэлементы, витамины и факторы роста.
Часто в культуральные среды вносят сложные питательные добавки: к культурам животных клеток добавляют сыворотку крови, а к культурам растительных — кокосовое молоко. Чтобы обеспечить полную воспроизводимость данных, лучше всего там, где это возможно, пользоваться питательной средой постоянного состава. В подходящей среде в процессе роста и деления клеток образуются группы клеток, на которых и проводят исследование. Если культуру необходимо аэрировать (например, когда она представляет собой жидкую суспензию), коническую колбу или специальный сосуд с суспензией встряхивают или вращают. В тех случаях, когда требуется получить дезагрегированную суспензию, в раствор добавляют определенные ферменты, например трипсин к суспензии животных клеток или пектиназы к суспензии растительных.
Оценку клеточного роста на основе подсчета количества клеток и увеличения клеточного объема, позволяющих судить о размере клеток, удобнее проводить не в интактной ткани, а в клеточной суспензии. Соединение, внесенное в культуральную среду, поступает непосредственно в клетки, что позволяет легко проследить за
Гл. 1. Общие принципы биохимического исследования 35
действием этого соединения на рост и обмен веществ в клетке. Применение этого метода для культивирования растительных клеток с удаленной внешней стенкой (культуры протопластов) и для поддержания роста вирусов еще более расширяет границы его использования.
Клеточные культуры" широко используют в микробиологии для получения в большом количестве водорослей, грибов и бактерий для исследовательских целей. Для выращивания микроорганизмов применяют как жидкие, так и твердые среды; по своему химическому составу они, как правило, менее сложны, чем те, которые применяются для выращивания культур клеток животных и высших растений. Скорость роста микроорганизмов во много раз выше, чем скорость размножения других клеточных культур, поэтому поддерживать стерильность культур растительных и животных клеток чрезвычайно трудно — любое заражение культуры микробами приводит к быстрому инфицированию выращиваемой культуры.
Подобно другим методам in vitro, применение тканевых и клеточных культур ставит перед исследователями проблему экстраполяции полученных результатов к целому организму, особенно в тех случаях, когда при культивировании растительные и животные клетки дифференцируются.
1.10. Фракционирование клеток
Фракционирование клеток состоит из двух последовательных стадий — гомогенизации и разделения. На стадии гомогенизации структура ткани разрушается и ткань превращается в так называемый гомогенат. На второй стадии — разделении — происходит группирование отдельных компонентов гомогената по принципу общности их физических свойств, таких, как размер и плотность.
При идеальных условиях выделения внутриклеточные компоненты можно было бы получать в том же виде и количестве, в которых они существуют в интактных клетках, не нарушая таким образом их морфологической структуры и не изменяя их активности. Однако большинство существующих в настоящее время методов фракционирования всем этим требованиям не удовлетворяет, и при выборе того или иного метода часто приходится иметь в виду, что в ходе фракционирования за счет сохранения морфологической структуры клетки может нарушиться ее активность, и наоборот.
Выбор ткани для фракционирования определяется конкретными условиями эксперимента и объектом исследования. Ткани и клетки различных органов различаются по составу, хрупкости и плотности,- что в свою очередь определяет выбор того или иного метода выделения. Печень, например, является идеальным объектом для изучения функционирования митохондрий, поскольку именно 2*
36 Часть I. Общие вопросы
в клетках печени митохондрии содержатся в особенно больших количествах. Ткань тимуса (зобной железы) чаще других тканей используется для выделения ядер, так как ядра тимоцитов составляют до 50% клеточной массы.
Клетки различных тканей обычно гетерогенны по форме и размерам; подобная гетерогенность точно в такой же степени характерна и для выделяемых из гомогенатов тканей субклеточных фракций. В этой связи химический анализ выделенных фракций может дать лишь усредненные данные о составе этих фракций. Различные органы животных отличаются друг от друга и по содержанию в них крови и соединительной ткани: чем больше соединительной ткани содержится в органе, тем хуже ткань поддается гомогенизации и тем труднее поэтому выделить из нее субклеточные компоненты.
1.10.1. Приготовление гомогенатов тканей и клеток
