Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Для получения наглядного представления о распределении введенных мелким лабораторным животным радиоактивкых соединений успешно применяется метод авторадиографии препаратов целого организма (разд. 6.2.4). Этот метод позволяет получить данные о распределении и относительном содержании введенного соединения в тканях животного, скорости его Еыведения и способности проникать сквозь биологические мембраны. Через определен-
30 Часть I. Общие вопросы
Рис. 1.3. Авторадиограмма целого организма мыши после введения 14C-L-DOPA (с разрешения Roche Products Ltd., Welwyn Garden City).
Темная окраска указывает на присутствие в данном месте радиоактивного изотопа; концентрация его особенно высока в печени, поджелудочной железе, почках, коже и переднем мозге.
/ — мышцы; 2 — почка; 3 — поджелудочная железа; 4 — желудок; 5 — позвоночник; 6 — мозг; 7 — передний мозг; 8 — рот; 9 — гипофиз; 10 — слюнная железа; // — кожа; 12 — сердце; 13 — диафрагма; 14 — печень; 15 — кишечник.
ный промежуток времени после введения соединения животное умерщвляют с помощью анестезии и быстро замораживают смесью ацетона с твердым С02 при температуре —78° С или с помощью жидкого азота. Замороженное животное помещают при низкой температуре в водный раствор смолы (аравийская камедь), а после застывания смолы рассекают на соответствующем уровне резцом, прикрепленным к электродрели, или делают секционные срезы с помощью микротома со специальным лезвием из карбида вольфрама. Полученный срез прикладывают к рентгеновской пленке и оставляют на I—2 нед при низкой температуре, после чего пленку проявляют. Сопоставляя полученную авторадиограмму с цветным снимком среза, изучают распределение и локализацию введенного животному изотопа в различных его органах и тканях. Типичная авторадиограмма изображена на рис. 1.3.
1.5. Изотонические солевые растворы
При проведении экспериментов на органах животных, срезах растительных и животных тканей, гомогенатах и клеточных орга-неллах необходимо, чтобы среда для суспендирования имела не только определенный pH, но и заданный ионный состав. Среда должна быгь изотонической, т. е. осмотическое давление в ней
Гл. 1. Общие принципы биохимического исследования 31
должно совпадать с осмотическим давлением внутри клетки или клеточной органеллы, чтобы их метаболическая целостность не нарушалась. Кроме того, если, например, изучают рост клеток, среда для суспендирования должна содержать все необходимые основные питательные вещества. Это требование нужно особенно тщательно выполнять при изучении культур клеток и тканей, особенно культур животных клеток.
Существует целый ряд физиологических солевых растворов, многие из которых являются разновидностями одного из первых — раствора Рингера. К ним относятся растворы Тайрода, Янга, Лока, Менга и Да Жалона. Наиболее часто применяются фосфатный и бикарбонатный растворы Кребса—Рингера. По своему ионному составу бикарбонатный солевой раствор близок к сыворотке крови млекопитающих. Фосфатный раствор Кребса—Рингера не является физиологическим, но может с успехом применяться для изучения срезов и гомогенатов тканей в тех случаях, когда поглощение кислорода измеряют манометрическими методами (разд. 8.6.2). Большинство этих солевых растворов содержат в различных количествах NaCl, КС1, MgS04, СаС12, NaHCOs и КН2Р04; некоторые растворы насыщены смесью газов — кислорода и углекислого газа. Кроме того, в их состав могут входить такие соединения, как глюкоза, пируват, фумарат и оксалоацетат. Для исследования культур животных тканей используются растворы Хэнкса и Гей—Эрля. Выбор того или иного раствора вначале является произвольным и не основывается на объективных данных, поэтому перед его применением необходимо убедиться, что состав его оптимален. И, наконец, при проведении физиологических экспериментов нужно следить за тем, чтобы эффекты, наблюдаемые при изменении pH среды, были вызваны изменениями в концентрации ионов водорода, а не какими-либо другими изменениями буферного раствора.
1.6. Перфузия изолированных органов
Сущность этого метода заключается в том, что изучаемый орган (печень, почку или сердце) изолируют из организма животного и помешают в специальный термостатируемый прибор. Затем к пер-фузионной жидкости, которая обычно вводится в орган через артерию, добавляют исследуемое соединение и анализируют жидкость, вытекающую из органа через вену, что позволяет проследить за превращениями введенного соединения. Перфузионную жидкость можно пропускать через орган однократно или несколько раз, самотеком или с помощью небольшого насоса. Насос применяют тогда, когда перфузионную жидкость пропускают через орган многократно. В отдельных случаях жидкость прогоняют не при постоянном давлении, а импульсами, что позволяет приблизить условия опыта
32 Часть I. Общие вопросы
к ситуации in vivo и имитирует процесс перекачивания крови сердцем.
Для проведения перфузии не обязательно полностью изолировать орган; ее можно проводить и на органе вскрытого анестезированного животного. При этом удается сохранить интактными нервные волокна и часть сосудистой системы.
