Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Электрод Кларка состоит из платинового катода и серебряного анода, погруженных в один и тот же раствор концентрированного хлористого калия и отделенных от исследуемого раствора мембраной. Этот электрод применяется для изучения биохимических реакций наиболее широко, поскольку мембрана (которая обычно изготавливается из политетрафторэтилена, например тефлона) защищает электроды от загрязнения химическими реагентами, содержа щимися в исследуемом растворе, и, таким образом, устраняет один и з недостатков, свойственных открытому электроду. Наличие мембраны, правда, увеличивает постоянную времени прибора. Существует много разновидностей электрода Кларка; к числу наиболее распространенных относится электрод Рэнка (рис. 7.12).
7.8.2. Работа с электродом Рэнка
Раствор насыщенного или 1 М хлористого калия наливают таким образом, чтобы покрыть серебряный и платиновый электроды. Над платиновым электродом на подложке с небольшим отверстием помещают полуторасантиметровый квадратный кусочек тефлона толщиной 12 мкм, который затем фиксируется реакционным сосудом. При этой операции следует обратить внимание, чтобы мембрана не перекрутилась и под нее не попали пузырьки воздуха. Затем в термостатированный реакционный сосуд с магнитной мешалкой с помощью пипетки наливают буферный раствор, предварительно
Гл. 7. Потенциометрия, электрометрия и полярография 241
выдержанный несколько часов при температуре реакции. При закрывании сосуда пробкой нужно следить, чтобы весь воздух из сосуда вышел. После заполнения сосуда включают мешалку. Буфер используют для установления самописца прибора на 100% насыщения кислородом. Значение для 0% кислорода получают добавлением к буферу небольших количеств дитионита натрия или вытеснением кислорода из буферного раствора азотом. Затем вместо буфера наливают исследуемый раствор и другие необходимые растворы, также предварительно выдержанные при температуре опыта для установления равновесия, и с помощью самописца непосредственно регистрируют изменения содержания кислорода. В ходе эксперимента в реакционную смесь можно через пробку вносить шприцем небольшие добавки. После каждого опыта аппарат необходимо тщательно промывать, так как многие химические реагенты адсорбируются мембраной и стенками сосуда. Особую осторожность нужно соблюдать в том случае, когда в реакционной смеси имеются органические растворители.
7.8.3. Применение кислородного электрода
Кислородный электрод используют для исследования реакций, сопровождающихся выделением или поглощением кислорода. Эксперимент, как правило, занимает не более часа. Иногда, правда, проводят длительные исследования, например наблюдение за уровнем содержания кислорода в процессе роста микроорганизмов. Для работы такого рода необходимы приборы несколько иной конструкции. Менее продолжительными являются опыты по определению активности ферментов и исследования на митохондриях и хлоро-пластах.
Исследования на митохондриях. Изучение дыхательного контроля, а также исследование действия различных ингибиторов на дыхание митохондрий и измерение отношения АДФ/О (количество молекул АДФ, перешедших в АТф, в расчете на один атом потребленного кислорода) лучше всего проводить с помощью кислородного электрода. Если митохондрии выделить в очень тщательно контролируемых условиях и суспендировать в изотонической среде, содержащей фосфат и субстрат, то значительное поглощение кислорода будет происходить только в присутствии АДФ. О таких митохондриях говорят, что они «прочно сопряженные» и находятся в состоянии 3 (активном). Когда весь АДФ израсходован, скорость дыхания возвращается к исходному низкому уровню — состоянию 4 (неактивному). Отношение скорости дыхания в присутствии АДФ к скорости дыхания после того, как весь АДФ перешел в АТФ, известно под названием дыхательный контроль. Это отношение является мерой сопряжения дыхания и фосфорилирования. Высокое значение дыхательного контроля характерно для интакт-
0—502
242 Часть III. Аналитические методы
Митохондрии Субстрат,фосфат- / ныи изотон инее- I
кий буферу J АДФ
100% 02------------------*
0,7мк атомов 0%
Дыхательный
ЛДФ(2,0мкМ) ¦
Скорость X
Айф=Ц=2,86
Скорость Y ДНФ
Рис. 7.13. Запись поглощения кислорода для интактных митохондрий.
ных митохондрий, а низкое — для поврежденных, «разобщенных» митохондрий, которые поглощают кислород без добавления АДФ. Интактные митохондрии можно «разобщить» такими реагентами, как 2,4-динитрофенол. Типичный пример записи поглощения кислорода интактными митохондриями приведен на рис. 7.13. Кислородный электрод применяется для измерения отношения АДФ/О, что численно эквивалентно отношению Р/О. Теоретическое значение отношения P/О для «прочно сопряженных» митохондрий при окислении таких субстратов, как малат и а-кетоглутарат, где в роли ко-фермента выступает НАД+, равно 3. Для таких субстратов, как сукцинат, окисление которого идет в обход первого участка фосфо-рилирования, это отношение равно 2. На практике получаемые экспериментально значения Р/0 всегда несколько ниже, чем рассчитанные величины, что объясняется частичным разобщением, а также действием мембранных АТФаз.
