Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
связывающих участков на этих двух фермента! микрококковая нуклеаза может
связывать и расщеплять толы свободную ДНК, а ДНКаза I может связывать и
расщеплять га свободную ДНК, так и ДНК, связанную с поверхностью нуклео
сомы. Ваш коллега высказывает предположение, что если ДНК связанную с
какой-либо поверхностью, обработать ДНКазой I, к должна образоваться
лесенка из полос с интервалами в 10 нуклее тидов. Вы проверяете это
предположение, связав ДНК с пластик" вой поверхностью (чашка Петри),
покрытой полилизином, и обри ботав ее двумя ферментами: микрококковой
нуклеазой, расща. ляющей ДНК на крупные фрагменты, и ДНКазой I,
разрезагоща на такие фрагменты, которые различаются по длине на 10
нуклео} тидов. i
А. Почему при кратковременной обработке ядер микрококково| нуклеазой
получается набор полос, соответствующих фрагмента!
ДНК, каждый из которых отличается от следующего примерно щ 200
нуклеотидов?
Б. Если вы подвергнете ядра более жесткой обработке микрококку вой
нуклеазой, то какой результат будет получен после фракций нирования ДНК с
помощью гель-электрофореза? :
Клеточное ядро 135
время обработки, мин
Крыса " в. Объясните, как гипотеза вашего коллеги объясняет образование
фрагментов, отличающихся друг от друга по длине на 10 нуклеотидов,
при обработке ядер ДНКазой I.
9-9 Вам передали первые образцы только что открытого марсианского
микроорганизма, чтобы вы проанализировали его хромосомы. Клетки этого
микроорганизма напоминают клетки эукариот, обитающих на Земле, и состоят
из тех же молекул, включая ДНК, которая обнаружена в структуре, похожей
на клеточное ядро. Один из ваших коллег идентифицировал два основных
гистоно-подобных белка, связанных с ДНК (их масса примерно равна массе
ДНК). Вы выделяете из клеток ядра и обрабатываете их микрококковой
нуклеазой в течение разных периодов времени. Затем вы выделяете ДНК и
разделяете ее в агарозном геле параллельно с аналогичным препаратом ДНК
из ядер печени крысы. Как показано на рис. 9-7, продукты расщепления ДНК
из печени крысы дают стандартную лесенку полос, характерную для
нуклеосом, тогда как продукты расщепления ДНК марсианского микроорганизма
проявляются в виде растянутых зон шлейфа, причем размер минимального
фрагмента составляет около 300 нуклеотидов. В качестве контроля вы
выделяете из марсианского микроорганизма ДНК, свободную от белков, и
обрабатываете ее микрококковой нуклеазой. ДНК оказывается весьма
чувствительной к этой нуклеазе, и конечными продуктами расщепления
являются преимущественно моно- и динуклеотиды.
Указывают ли эти результаты на то, что в хроматине марсианского
микроорганизма также содержатся структуры, подобные нуклеосомам? Если это
так, то как расположены такие нуклеосомы по длине ДНК?
9-10 Строение нуклеосом в области центромеры
представляет особый интерес в связи с тем, что центромера является
областью присоединения хромосомы к микротрубочкам. Для прикрепления
трубочек обычное расположение нуклеосом в хроматине, возможно, должно
быть изменено. Вы собираетесь разобраться в этом вопросе, поскольку
провели клонирование и определили последовательность нуклеотидов во
фрагменте ДНК длиной около 2 т. п. н., который расположен вокруг
центромеры (CEN3) дрожжевой хромосомы III. В результате вы можете изучить
расположение нуклеосом не только в нативной хромосоме, но также и в
плазмиде, с помощью которой вы клонировали различные по длине фрагменты
той области хромосомной ДНК, которая окружает центромеру (рис. 9-8).
Вы выделяете хроматин из дрожжей
дикого типа и из дрожжей, несущих отдельные плазмиды. Затем
кратковременно обрабатываете эти препараты хроматина микрококковой
нуклеазой, после чего депротеинизируете ДНК и обрабатываете ее нуклеазой
BamHI, которая разрезает ДНК лишь в одном месте-в области центромеры
(рис. 9-8). ДНК, обработанную таким образом, вы фракционируете с помощью
гель-электрофореза и затем анализируете методом блот-гибридизации,
используя в качестве зонда фрагмент радиоактивно меченной ДНК центромеры
(рис. 9-8). Этот метод, называемый "непрямое мечение концов", позволяет
выявить все фрагменты ДНК, начиная с ДНК, расположенной непосредственно
справа от участка расщепления ферментом BamHI. Контрольный опыт состоит в
том, что вы депротеинизируете препарат хроматина, чтобы получить чистую
ДНК, обраба-
0,5 1 2 4 8 15 30
t
Pic. 9-7. Расщепление хроматина Ю марсианского микроорганизма
микрококковой нуклеазой (задача 9-9). Справа приведены результаты
обработки хроматина из печени крысы.
136 Глава 9
Рис. 9-8. Схема нативной хромосомы и трех плазмид, сконструированных
вокруг CEN3 (задача 9-10). Нативная хромосома имеет линейную форму; ее
