Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
3. Инфицированные клетки дикого типа, слившиеся 85% 15%
с неинфицированными клетками дикого типа
Радиоактивный G-белок был очищен и затем обработан лектином,
специфически осаждающим белки, содержащие галактозу. В таблице приведены
уровни радиоактивности осадка (G-белок с галактозой) и супернатанта (G-
белок без галактозы) в процентах от общей радиоактивности.
A. Между какими двумя компартментами аппарата Гольджи исследовалось
движение белков в этом эксперименте? Объясните ваш ответ.
Б. Если бы белки продвигались по аппарату Гольджи за счет образования
цистерн, то какие результаты можно было бы предсказать для описанного
здесь эксперимента? Если бы белки проходили через аппарат Гольджи в
транспортных везикулах, то каковы тогда были бы результаты?
B. Какую из этих двух моделей подтверждают результаты опыта,
представленные в табл. 8-2?
8-33 Вы получили несколько линий мутантных клеток, дефектных по
способности присоединять углеводы к экспортируемым белкам. Используя
белок, содержащий только N-связанные сложные олигосахариды и легко
поддающийся очистке, вы проанализировали состав этих олигосахаридов в
клетках разных мутантов. Оказалось, что все мутанты различаются по
качественному и количественному составу олигосахаридов (табл. 8-3).
A. Расположите мутанты в таком порядке, который соответствует этапам
процессинга N-связанных олигосахаридов.
Б. Какие из мутантов дефектны по процессингу, проходящему в ЭР, а
какие-по процессингу, проходящему в аппарате Гольджи?
B. Какие из мутантов вероятнее всего дефектны по ферменту процессинга,
непосредственно отвечающему за модификацию N-связанных олигосахаридов?
Какие мутанты могут быть дефектными не по ферменту процессинга, а скорее
по другому ферменту, затрагивающему процессинг олигосахаридов лишь
косвенно?
8-34 G-белок вируса везикулярного стоматита (VSV) это типичный мембранный
гликопротеин. Кроме сигнального пептида, отщепляемого после попадания
белка внутрь ЭР, в его составе есть также единственный сегмент,
пронизывающий мембрану. С помощью него G-белок удерживается в
плазматической мембране, так что
120 Глава 8
Рнс. 8-18. Пронизывающие мембрану домены G-белков из нормальных и
мутантных вирусов VSV (задача 8-34). В номерах плазмид отражено число
аминокислот в сегментах, пронизывающих мембрану; например, pMS20
означает: дикий тип, в сегменте содержится 20 аминокислот. Штриховыми
линиями обозначены аминокислоты, отсутствующие в результате мутаций.
Буквы в прямоугольниках обозначают основные аминокислоты на концах
сегментов, пронизывающих мембрану.
Таблица 8-3. Анализ сахаров, содержащихся в N-связанных олигосахаридах из
клеток дикого типа и из клеток мутантных линий, дефектных по процессингу
олигосахаридов (задача 8-33)
Клеточная линия Man GtoNAc Gal NANA Gl<
Дикий тип 3 4 2 2 0
Мутант А 3 4 0 0 0
Мутант В 5 3 0 0 0
Мутант С 9 2 0 0 3
Мутант D 9 2 0 0 0
Мутант Е 5 2 0 0 0
Мутант F 3 3 0 0 0
Мутант G 8 2 0 0 0
Мутант Н 9 2 0 0 2
Мутант I 3 4 2 0 0
Сокращения: Мап-манноза; GlnNAc-N-ацетилглюкозамин; Gal-галактоза;
NANA-N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота); Glc- глюкоза.
Цифрами указано число мономеров соответствующего сахара в данном
олигосахариде.
его короткий С-концевой домен оказывается в цитоплазме, а гораздо
более крупный, N-терминальный домен выступает с наружной стороны клетки.
Трансмембранный сегмент состоит из 20 незаряженных и преимущественно
гидрофобных аминокислотных остатков, к которым с обоих концов примыкают
остатки основных аминокислот (рис. 8-18). Отрезка полипептидной цепи из
двадцати аминокислот, образующих а-спираль, как раз достаточно для
пересечения липидного бислоя толщиной 3 нм.
Чтобы проверить, какой длины должен быть сегмент, пронизывающий
мембрану, вы модифицируете клонируемый ген G-бел-ка, чтобы получить ряд
мутантных белков, у которых этот сегмент короче (см. рис. 8-18). При
введении модифицированных плазмид в культивируемые клетки каждый
мутантный ген практическв не отличался по уровню экспрессии от гена
дикого типа. Вы анализируете распределение измененных G-белков внутри
клеток несколькими способами.
1. Вы выясняете локализацию модифицированных G-белков в клетке с
помощью метода иммунофлуоресцентной микроскопии, используя специфичные к
G-белкам антитела с флуоресцентными маркерами.
Сегмент,
пронизывающий
мембрану
pMS20 К S S I А S F F F I I GLIIGL F L V L R
pMS18 к S S I А S F F F I I G L---G L F L V L R
pMS16 к S S I А S F F F I I G-------L F L V L R
pMS14 к S S I А S F F F I I F L V L R
