Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
добавили микро сомы до начала трансляции. Во втором варианте вы добавил
микросомы после завершения трансляции (вместе с циклогексим" дом, нужным
для подавления любого дополнительного белковой синтеза). Чтобы выявить
транслокацию, вы обрабатывали некою рые пробы протеазой либо разрушали
микросомы и проводил обработку эндогликозидазой Н (эндо-Н), а затем с
помощьи гель-электрофореза с ДСН выявляли образовавшиеся продукт!
(рис. 8-12).
Переносятся ли белки от каждой
мРНК в микросомы, когд трансляция происходит в присутствии микросом?
Удалось ли вам получить разобщение
транслокации и трансляцш в каком-нибудь из вариантов? Объясните ваш
ответ.
Подтверждают ли полученные
результаты идею о том, что рибо сомы проталкивают белки сквозь мембрану
ЭР, или же ои указывают на то, что белки протягиваются через мембрану
благо даря механизму переноса?
Почему перенос более коротких
белков может происходить неза висимо от трансляции, а перенос более
длинных белков-нет?
8-27 Хотя точный механизм
котрансляционного встраивания белка в мембраны не известен, можно
предсказать окончательное распо ложение белка в мембране, если известны
его сегменты, пронизы вающие мембрану. Если пронумеровать эти сегменты с
N-конца то нечетные начинают транслокацию (действуя, как пептида "начала
переноса"), а четные заканчивают ее (действуя, как пептн ды "конца
переноса"). Далее, поскольку пептиды погружаюта в мембраны, как шпильки в
волосы, пептиды начала перенос ориентируются своими N-концами в сторону
цитоплазмы, I С-концами-к просвету ЭР. Благодаря такой ориентации сегма
тов начала переноса фиксируется противоположная ориентацш сегментов конца
переноса, так что их N-концы направлены в сто рону просвета ЭР, а С-
концы-к цитоплазме.
На рис. 8-13 схематически
изображены четыре мембранни белка. Прямоугольниками изображены сегменты,
пронизывающ(r) мембрану, стрелки указывают места отщепления лидерных пептн§
Рис. 8-14. дов. Предскажите на основе описанного выше механизма котрано
бранного
Рис. 8-12. Результаты опытов по изучению сопряжения трансляции и
транслокации (задача 8-26). Показаны результаты с короткой (А), средней
(Б) и длинной (В) мРНК. Вариант обработки образцов перед электрофорезом
указан над схемой геля. Эндо-Н удаляет сахара, присоединенные к белкам в
ЭР.
8*
Внутриклеточная сортировка макромолекул
115
Рис. 8-13. Распределение пронизывающих мембрану сегментов в белках,
которые нужно встроить в мембрану ЭР (задача 8-27). Прямоугольниками
изображены эти сегменты, а стрелками указаны места полипептидной цепи,
где отщепляются сигнальные пептиды.
N -
1
В
N-[
>Ч!
И-
iee I )ы| их I ю-
ЛИ j
га-1
>ГО
го-
ли
ью
ы
да
1ИИ]
бо-1
)Ш I го-
;за-
ков|
по-
зы-
ща,1
[ДЫ|
;ти-!
ТСЯ1
оса! ' а| ,ен'1 ЦИХ]
;то-| ЯЫ||
п
т
N - 1
w;
\y\sc
8-28
ляционного встраивания, каким образом каждый из белков будет
располагаться в мембране ЭР. Укажите, как ориентированы N-и С-концы по
отношению к цитоплазме и просвету ЭР.
Вас заинтересовало, что расположение белка в мембране в принципе может
определяться самой последовательностью аминокислотных остатков. График
гидропатии аминокислотных остатков вдоль цепи можно использовать для
идентификации гидрофобных областей, которые, вероятно, соответствуют
сегментам цепи, пронизывающим мембрану. На основе правил
котрансляционного встраивания вы могли бы предсказать, какие участки
белка будут выступать в цитоплазму, а какие-на поверхность клетки. Вы
хотите проверить свои предположения на Е. coli, объекте, позволяющем
привлечь для решения проблемы мощные средства генетического анализа.
В качестве тестового белка вы выбираете мембранный белок с
известной аминокислотной последовательностью, который клонируете с
помощью плазмиды.
График показателя гидропатии этого белка представлен на рис. 8-
14. Вы хотите проверить свои предсказания, получив гибридные белки,
которые состоят из мембранного белка на N-конце и щелочной фосфатазы на
С-конце. Щелочную фосфатазу легко определять в целых клетках, и в ее
молекуле нет сколько-нибудь протяженных гидрофобных участков. Более того,
когда она локализована на цитоплазматической стороне мембраны, ее
активность низка, а когда она располагается на внешней стороне мембраны
(в периплазматическом пространстве), ее активность высока.
i'8-14. График гидропатии мем-иого белка (задача 8-28).
Номер аминокислоты в полипептидной цепи
116 Глава 8
Рис. 8-15. Структуры гибридных белков для проверки предсказаний о
расположении белков в мембране, сделанных на основе данных по гидропатии
