Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
(
U
Рис. 8-1]
гена дл трансляз 8-26). Ю иости д делах б< промот< в мален) Места р
ментам] стрелка] ражены дукты т расщеш
8-1428
Внутриклеточная сортировка макромолекул 113
Рис. 8-10. Результаты опыта по трансляции очищенной мРНК в присутствии и
в отсутствие микро-сомных мембран (задача 8-25). Вариант обработки
продуктов трансляции перед гель-электрофорезом указан над каждой
дорожкой. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле с ДСН, в котором
белки разделяются на основе их размеров, так что белки с более низкой
молекулярной массой оказываются дальше от старта.
ОБРАБОТКА
Протеаза
Детергент
Эндо-Н
В ОТСУТСТВИЕ МИКРОСОМ
- +
+ -+ -- +
В ПРИСУТСТВИИ МИКРОСОМ - + + -- - + -- - - +
Промотор
Последовательность
гликозилирования
t t t t
Сигнальная Участки
последовательность рестрикции
Короткая мРНК
Средняя мРНК
Длинная мРНК__________
Р*с. 8-11. Схема клонированного гена для изучения сопряжения трансляции и
транслокации (задача
8-26). Кодирующие последовательности для белков находятся в пределах
большого прямоугольника; промоторная последовательность-в маленьком
прямоугольнике слева. Места расщепления матрицы ферментами рестрикции
указаны Стрелками. Под картой гена изоб-ражены три молекулы мРНК-продукты
транскрипции по-разному расщепленных матриц.
экспериментальным критериям: 1) защищенность вновь синтезированного
белка от экзогенно добавляемых протеаз и незащищенность от протеаз в
присутствии детергентов, используемых для растворения защитного липидного
бислоя; 2) гликозилирование вновь синтезированных белков
олигосахаридтран'сферазами, локализованными исключительно в просвете ЭР;
3) отщепление сигнальных пептидов сигнальной пептидазой, которая тоже
активна только на поверхности мембраны ЭР, обращенной в просвет ЭР.
Вы хотите использовать эти критерии, чтобы выяснить, переносится
ли синтезированный на очищенной мРНК белок через микросомную мембрану.
Для этого вы транслируете мРНК в белок в бесклеточной системе в
присутствии микросом и без них. Затем вы проводите опыт в 4 вариантах:
1) без обработки; 2) добавление протеазы; 3) добавление про-
теазы и детергента и 4) разрушение микросом и добавление эндогликозидазы
Н (эндо-Н), которая отщепляет N-связанные сахара, соединенные с ЭР.
Электрофоретический анализ этих препаратов показан на рис. 8-10.
A. Объясните экспериментальные результаты для вариантов, в которых
микросом в инкубационной среде не было (рис. 8-10, дорожки 1-4).
Б. Используя три критерия, перечисленные в этой задаче, решите,
указывают ли данные, полученные в вариантах, где были добавлены микросомы
(рис. 8-10, дорожки 5-8), на то, что белок переносится через микросомную
мембрану. Объясните перемещение белков, соответствующее дорожкам 5, 6 и
8.
B. Заякоривается ли белок в мембране или полностью переносится через
нее?
8-26 Поступление секреторных и мембранных белков в просвет ЭР, как
правило, прочно сопряжено с белковым синтезом. Котрансляцион-ный характер
переноса (транслокации) у эукариот дает возможность применять
чувствительный и специфический способ изучения ранних этапов биосинтеза
этих белков. Однако это же создает серьезную трудность при выяснении
механизма переноса. Например, в такой сопряженной системе трудно
определить, "проталкивают" ли рибосомы белок сквозь мембрану, или он
"протягивается" через нее за счет механизма переноса.
С целью разобщить трансляцию и транслокацию вы осуществили
клонирование гена в плазмиде рядом с промотором для РНК-полимеразы
бактериофага (рис. 8-11). Такое расположение позволяет получить
транскрипцию гена in vitro при добавлении
1-1428
114 Глава 8
Протеаза Трансляция Микро сомы Трансляция Микросомы
Трансляция
в присутствии добавлены в присутствии добавлены в
присутствии
микросом после трансляции микросом после трансляции
микросом
- + - - + - - + - - + - -
+ "
Эндо-Н - - + - - + - - 4* - - + -
- +
Рис. 8-13. F
Микросомы добавлены после трансляции вающих ме
ках, которъ
- + -
- - +
мембрану ^ угольникам
фаговой РНК-полимеразы. Кроме того, путем разрезания плазм" ды в
разных сайтах внутри гена вы можете создавать боли короткие мРНК по
сравнению с нормальными (рис. 8-11). Вь приготовили три мРНК, показанные
на рис. 8-11, и провели ш трансляцию in vitro. В одном варианте опыта вы
