Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
___В. Белки, прикрепленные к мембране при участии миристиновой
кислоты, заякорены своим N-концом; белки, прикрепленные к мембране
при участии пальмитиновой кислоты, заякорены вблизи своего С-конца.
___Г. Ключевые регуляторные белки, например такие, которые катализируют
реакции, определяющие скорость метаболизма, обычно являются долгоживущими
белками, что соответствует их особой важности для клетки.
___Д. Убикитин-это ATP-зависимая протеаза, которая быстро расщепляет
белки, маркированные для деградации.
___Е. Наиболее надежный путь для выяснения полной аминокислотное
последовательности цитозольного белка в его функционально! форме-это
секвенирование его гена.
8-6 Время жизни молекулы белка обычно соответствует той функции которую
он выполняет in vivo; например, структурные бели относятся к
долгоживущим, тогда как регуляторные белки-это как правило,
короткоживущие молекулы. Время жизни бели в эукариотической клетке может
сильно зависеть от его N-конце-вой аминокислоты. В опытах, с помощью
которых было показаю влияние N-концевых аминокислот на стабильность
белка, исполь зовали гибридный белок, состоявший из убикитина, ковалентнс
сшитого с р-галактозидазой. Исследователи, обнаружившие эти явление,
изучили разнообразные плазмиды, кодирующие различные варианты гибридного
белка. Три такие плазмиды схематически представлены на рис. 8-1. Когда
эти плазмиды вводил!
Расщепление
УБИКИТИН 1 J3-ГАЛАКТОЗ ИД АЗ А
в мш?о-\щшшттжтттш:к
78 аминокислот 1045 аминокислот
Рис. 8-
тремя белкал форет] актив* ченнор мощы амино столб* ции р-шения р-гала
центах имеви] синтез
0-галак1
Рис. 8-
р-гала]
взаимс
телам*
Сокра]
цевых
столби
р-гала]
Внутриклеточная сортировка макромолекул 103
Рис. 8-2. Результаты опытов с тремя различными гибридными белками (задача
8-6). А. Электрофоретическое выделение радиоактивной Р-галактозидазы,
полученной путем осаждения с помощью антител, N-концевые аминокислоты
указаны над каждым столбиком. Б. Динамика деградации (3-галактозидазы
после завершения синтеза белка. Уровень Р-галактозидазы выражается в
процентах от начального количества, имевшегося сразу после остановки
синтеза белка.
А. АКРИЛАМИДНЫЙ ГЕЛЬ
Б. КИНЕТИКА РАСЩЕПЛЕНИЯ
О 1
О о X I
Время,
мин после
остановки трансляции
в дрожжевые клетки, последние синтезировали гибридные белки, но
убикитин отщеплялся (неидентифицированным ферментом) точно по месту его
соединения с Р-галактозидазой. В результате возникали молекулы Р-
галактозидаз с разными N-концами (см. рис. 8-1).
Чтобы оценить период полужизни этих р-галактозидаз, дрожжи
выращивали на протяжении нескольких поколений в присутствии радиоактивной
аминокислоты. Затем синтез белков блокировали с помощью соответствующего
ингибитора. Для определения скорости деградации р-галактозидазы из
культуры отбирали пробы в разные моменты времени, проводили очистку р-
галактозидазы с помощью специфических антител и измеряли количество
радиоактивной р-галактозидазы после гель-электрофореза с детергентом-до
децилсульфатом натрия (ДСН). Результаты электрофореза для пробы,
отобранной через 5 мин после добавления ингибитора, представлены на рис.
8-2, А. Динамика деградации за весь период отбора проб показана на рис.
8-2, Б.
А. С помощью метода рекомбинантной ДНК можно было бы создать ряд
плазмид с измененным первым кодоном гена р-галактозидазы. Как вы думаете,
почему не был использован этот более прямой путь?
Б. Оцените период полужизни трех различных видов р-галактозидаз
(время, за которое деградирует половина материала).
В-галактозидаза-
Рис. 8-J Электрофорез немеченой р-галактозидазы и последующее
взаимодействие с мечеными антителами к убикитину (задача 8-7).
Сокращенные обозначения N-koh-цевых аминокислот указаны над столбиками.
Положение нативной Р-галактозидазы указано стрелкой.
8-7 Когда вы узнали о работе, описанной в предыдущей задаче, вас
заинтересовали два аспекта представленных там данных. Во-первых,
действительно ли убикитин удалялся с N-конца? Во-вторых, чему
соответствуют полосы, расположенные над полосами р-га-лактозидазы на
электрофореграмме (рис. 8-2, А)? Любые фрагменты р-галактозидазы,
образующиеся при ее деградации, должны находиться на электрофореграмме
ниже полосы р-галактозидазы.
Чтобы проверить, действительно ли р-галактозидаза высвобождается
в результате отщепления убикитина от образовавшегося гибридного белка, вы
выделяете с помощью антител нерадиоактивную р-галактозидазу из клеток,
содержащих те же три плазмиды. Затем вы подвергаете эти образцы гель-
электрофорезу с ДСН, переносите пластины геля на фильтровальную бумагу и
проводите реакцию взаимодействия с радиоактивными антителами против
убикитина. Как видно из рис. 8-3, антитела к убикитину не
