Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
присутствии и в отсутствие ингибиторов протеаз, позволяет думать, что
регуляторный домен киназы чувствителен к расщеплению протеазами
клеточного экстракта. Поскольку именно регуляторный домен должен
взаимодействовать с кальмоду-лином, то неудивительно, что лишенная
регуляторного домена киназа на колонке с кальмодулином не задерживается.
В свою очередь, активация киназы вследствие протеолитического удаления
(или разрушения) регуляторного домена дает основание заподозрить, что
этот домен каким-то образом "закрывает" активный центр. При связывании
комплекса Са2+-кальмодулин эта регуляторная "заслонка" открывается и
киназа начинает работать. Такие регуляторные заслонки, прикрывающие
активный участок, распространены, по-видимому, достаточно широко.
Б. Ионы Са2+, проникнув в цитоплазму, связываются с кальмодулином и
вызывают изменение его конформации. Комплекс Са2+-кальмодулин связывается
с регуляторным участком киназы легких цепей миозина, "освобождая" ее
активный центр. Активированная киназа фосфорилирует легкие цепи миозина,
которые при этом тоже меняют свою конформацию; теперь они могут
взаимодействовать с актином и инициировать таким образом сокращение.
Можно предположить, что оканчивается сокращение благодаря работе
фосфатаз, удаляющих с легких цепей миозина фосфатные группы.
B. Аффинная хроматография на колонке с кальмодулином в качестве
первой стадии очистки киназы легких цепей миозина вряд ли будет
эффективной-в клетках очень много кальмодулина, обычно около 1% от общего
белка клетки. В присутствии Са2 + киназа будет связана с комплексом Са2+-
кальмодулин, присутствующим в клеточном экстракте, и эффективного
связывания с кальмодулином на колонке не получится. Поэтому две первые
стадии в вашей процедуре очистки необходимы для того, чтобы отделить
эндогенный кальмодулин и тем самым сделать возможным взаимодействие
киназы с кальмодулином в колонке.
Литература: Adelstein, R.S.; Klee, С. В. Smooth muscle myosin
light-chain kinase. In Calcium and Cell Function (W. Y. Cheung, ed.),
Vol. 1, pp. 167-182. New York: Academic Press, 1980.
12-23
А. Эффект ионов Са2 + и диацилглицерола на функцию тромбоцитов
указывает на то, что в их активации участвует фосфолипаза
С. Коллагеновые волокна и тромбин активируют находящийся на
поверхности тромбоцита рецептор, который в свою очередь активирует
фосфолипазу С (предположительно, с помощью G-белка). Фосфолипаза С
расщепляет фосфатидилинозитол-бисфосфат с образованием InsP3 и
диацилглицерола. InsP3 вызывает мобилизацию запасов Са2 + , в результате
чего активируется киназа легких цепей миозина и происходит их
фосфорилирование. Эту ветвь процесса можно стимулировать с помощью
кальциевого ионофора А23187. Диацилглицерол акти-
30-1428
466 Глава 12
ПЕРЕДАЧА ВНУТРИ- АКТИВИРОВАННЫЕ ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ РЕАКЦИЯ
СИГНАЛА КЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ БЕЛКИ-МИШЕНИ КЛЕТОК
ПОСРЕДНИКИ
Тромбин
Коллаген
Киназа легких цепей миозина
"Легкая цепь, миозина
, Изменение формы
Диацилглицерол-
С-киназа
Белок 40 кДа
Экзоцитоз
Выброс " серотонина
Плазматическая
мембрана
Рис. 12-22. Механизм активации тромбоцитов (ответ 12-23).
вирует С-киназу, фосфорилирующую белок с мол. массой 40 кДа; эту ветвь
процесса можно стимулировать непосредственно диацилглицеролом. Для
стимуляции выброса серотонина обе ветви процесса должны функционировать
совместно. Общая схема активации тромбоцитов представлена на рис. 12-22.
Б. Для секреции серотонина необходимы и Са2 + , и диацилглице-рол, так
как по отдельности они не вызывают секреции (рис.
12-10, Б). Эти эксперименты позволяют предположить, что в процессе
участвует белок с мол. массой 40 кДа, хотя прямых доказательств этому нет
и истинная роль данного полипептида неясна. Ионы Са2+, по-видимому, имеют
более непосредственное отношение к секреции и способствуют каким-то
образом слиянию мембран, необходимому для экзоцитоза.
Литература:
Nishizuka, Y. Calcium, phospholipid turnover and transmembrane signaling.
Phil. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 302, 101-112, 1983.
12-24
А. Зависимость активации от наружного кальция и способность кальциевого
ионофора активировать яйца указывают на то, что ключевой стадией в
активации яйца является вход Са2 + в клетку. Необходимость совместного
действия инозитолфосфатов можно объяснить двумя путями: 1) оба
инозитолфосфата вместе нужны для стимуляции ключевой стадии в механизме
входа Са2+ либо 2) процесс активации включает две стадии, каждая из
которых контролируется своим инозитолфосфатом. Поскольку известно, что
