Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
эритроцитов и лишь около 1 % этих соединений в целых клетках.
А. Результаты этих опытов представлены в табл. 6-2. Они позволяют судить
о распределении четырех основных фосфолипидов в мембранах эритроцитов.
Какие фосфолипиды сосредоточены в обоих монослоях этих мембран и есть ли
такие?
Б. Почему в этих опытах использовали эритроциты?
Таблица 6-2. Чувствительность фосфолипидов в составе эритроцитов человека
и в составе теней этих клеток к фосфолипазам и к метке SITS, не
проникающей через мембрану (задача 6-5)
Фосфолипид Сфингомиелиназа Яд морских змей Флуоресценция
SITS
Эритро Тени Эритро Тени Эритро- Тени
циты циты циты
Фосфатидилхолин - - + + -
Фосфатидилэтано
ламин --- --- --- + - +
Сфингомиелин + + --- --- --- ---
Фосфатидилсерин --- --- --- + - +
Спин-меченный фосфолипид 2
Рис. 6-2. Схематическое изображение двух одинаковых липидов, меченных
нитроксильным радикалом в различных положениях. Вверху изображен
нитроксильный радикал, ниже показаны места его присоединения к молекуле
фосфолипида (задача 6-6).
6-6 За поведением липидов в двух монослоях мембраны можно проследить,
введя в отдельные молекулы в качестве метки нитро-ксильную группу,
являющуюся стабильным органическим свободным радикалом (рис. 6-2). Такие
спин-меченые липиды можно изучать методом электронного парамагнитного
спинового резонанса (ЭПР) непосредственно в живых клетках. Перед тем как
ввести спин-меченые липиды в мембраны клеток, смесь меченых и немеченых
фосфолипидов обрабатывают ультразвуком с целью получения маленьких
липидных везикул. При добавлении последних к суспензии целых клеток в
определенных условиях везикулы сливаются с клетками, перенося меченые
лиганды в их плазматическую мембрану.
На рис. 6-2 схематически изображены молекулы фосфолипида,
содержащие спиновую метку в двух разных положениях. Такие меченые
фосфолипиды вводили в мембраны эритроцитов описанным выше методом. Для
того чтобы выяснить, одинаково ли встраиваются меченые фосфолипиды в два
монослоя бислойной мембраны, в среду добавляли аскорбиновую кислоту
(витамин С). Будучи восстановителем, растворимым в воде, этот реагент не
проникает сквозь мембрану и разрушает все нитроксильные радикалы на
внешней поверхности клетки. На рис. 6-3 представлена зависимость сигнала
ЭПР от продолжительности инкубации клеток с двумя различными метками в
присутствии витамина С и без него.
4-1428
50
Глава 6
А Фосфолипид 1
Б Фосфолипид 2
Рис. 6-3. Уменьшение интенсивности сигнала ЭПР в зависимости от
длительности инкубации эритроцитов с меченым фосфолипидом 1 (А) и
фосфолипидом 2 (Б) в присутствии аскорбата и без него (задача 6-6).
Рис. 6-4. Уменьшение величины сигнала ЭПР от эритроцитов, содержащих
спин-меченые фосфолипиды в наружном и внутреннем монослоях плазматической
мембраны (задача 6-7).
A. Не учитывая пока различий в степени уменьшения сигнала ЭПР,
попытайтесь объяснить, почему фосфолипид 1 (рис. 6-3, А) взаимодействует
с аскорбиновой кислотой быстрее, чем фосфолипид
2 (рис. 6-3, Б). Заметьте, что область плато в случае фосфолипида
1 достигается за 15 мин, а в случае фосфолипида 2-гораздо медленнее, за 1
ч.
Б. Для выяснения причин того, почему эти фосфолипиды различаются по
скорости и величине уменьшения сигнала ЭПР, были проведены аналогичные
опыты с тенями эритроцитов, обработанными так, что они были непроницаемы
для аскорбата (из-за замыкания мембраны). В этих опытах в отсутствие
аскорбата не наблюдалось снижения величины сигнала ЭПР для обоих
фосфолипидов, а при добавлении аскорбата сигнал устанавливался на уровне
50%. Попробуйте объяснить, чем обусловлены различия в изменениях сигнала
ЭПР в опытах с тенями эритроцитов и с целыми эритроцитами (см. рис. 6-3).
B. Одинаково ли встраивались спин-меченые фосфолипиды 1 и 2 в оба
монослоя мембраны эритроцитов?
6-7 Асимметрическое распределение фосфолипидов по двум монослоям
плазматической мембраны указывает на то, что спонтанный перескок липида с
одной стороны мембраны на другую-редкое событие, хотя, возможно, любой
спонтанный перескок быстро компенсируется соответствующими переносчиками
фосфолипидов, возвращающими их на прежнее место в монослое. Для того
чтобы определить, какая из этих двух возможностей реализуется, была
измерена скорость перескока фосфолипидов в плазматической мембране
интактных эритроцитов.
В одном из экспериментов использовали те же два фосфолипида со
спин-метками, о которых шла речь в задаче 6-6 (рис. 6-2). С целью
измерения скорости транслокации от внутреннего монослоя к наружному
эритроциты со спин-мечеными фосфолипидами, сосредоточенными только во
