Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Уилсон Дж. -> "Молекулярная биология клетки " -> 24

Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.

Уилсон Дж., Хаит Т. Молекулярная биология клетки — М.: Мир, 1994. — 520 c.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка): molekulyarnayabiologiyakletki1994.djvu
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 308 >> Следующая

Находясь в недоумении, но
настойчиво продолжая исследование, вы проводите очистку фрагмента
размером 1,3 т.п.н. с помощью гель-электрофореза, контролируя структуру
путем обработки пробы рестриктазой BamHI. Как вы и ожидали, при этом
заново появляются две исходные полосы (рис. 5-40, Б). Чтобы убедиться
все-таки, что это именно та структура, которую вы хотели получить, вы
обрабатываете другую пробу рестриктазой EcoRI. Вы ожидали, что при этом
получатся два фрагмента длиной 300 нуклеотидов и один фрагмент размером
700 нуклеотидов. И снова вы удивлены сложностью набора полос в геле (рис.
5-40, Б).
А. Почему исходная смесь
соединяющихся фрагментов ДНК дает так много полос в геле?
Б. Почему при обработке очищенного
фрагмента длиной 1,3 т.п.н. рестриктазой EcoRI образуется так много
фрагментов?
Рис. 5-40. Сшивание фрагментов очищенной ДНК (А) и диагностическое
расщепление очищенного фрагмента длиной 1,3 т.п.н. (Б) (задача 5-50).
/
А
•У в"

J J* *

о"
•Г 5"
У А?* О?
Y <2? о
44 Глава 5
EcoRI BamHI
| ^---------4 т.п.н.-------1
c
Вставка
J
Вектор
Рис. 5-41. Рекомбинантная плазмида, содержащая клонированный сегмент ДНК
(задача 5-51).
Рис. 5-42. Радиоавтограмма, показывающая электрофоретическое разделение
меченых фрагментов после частичного расщепления тремя рестриктазами,
обозначенными разными символами (задача 5-51). Числа слева указывают
размеры маркерных фрагментов (в т.п. н.).
Рис. 5-43. Первые 30 аминокислот, определенные вашим коллегой с помощью
аминокислотного анализатора (задача 5-52).
5-51 Вы провели клонирование сегмента (4000 п. н.) интересующего вас гена
в плазмидном векторе (рис. 5-41) и теперь хотите получить карту
рестрикции этого гена, чтобы перейти затем к другим манипуляциям с ДНК.
Ваш руководитель оставил вам инструкции относительно того, как все это
нужно сделать, и отправился в отпуск, так что вы можете полагаться только
на себя.
Вы следуете его инструкциям, перечисленным ниже.
1. Разрезать плазмиду рестриктазой EcoRI.
2. Добавить к концам, образовавшимся после обработки EcoRI,
радиоактивную метку.
3. Разрезать меченую ДНК рестриктазой BamHI.
4. Очистить встроенную ДНК от плазмиды.
5. Обработать меченую ДНК-вставку рестриктазой в течение короткого
периода времени так, чтобы каждая меченая молекула была разрезана в
среднем один раз.
6. Повторить этап 5, используя разные рестриктазы.
7. Провести электрофорез частично расщепленных ДНК в агарозном
геле, причем препараты, обработанные разными рестриктазами, нанести на
гель рядом друг с другом.
8. Наложить гель на рентгеновскую пленку, чтобы получился
радиоавтограф фрагментов с радиоактивным концом.
9. Нарисовать рестрикционную карту.
Наиболее трудным для вас был этап 5, однако, уменьшая количество
фермента и снижая температуру, вам удалось подобрать условия для
частичного расщепления. Затем вы смогли полностью выполнить этап 8 и
получить радиоавтограмму, представленную на рис. 5-42.
К сожалению, руководитель не объяснил вам достаточно подробно,
как строить карту по данным радиоавтограммы. Он должен вернуться завтра.
Хватит ли вам времени, чтобы нарисовать ее?
5-52 Полночь. Вас разбудил коллега, чтобы поделиться еще одним
грандиозным проектом. Он потратил два последних года на очистку белка,
представляющего собой сильный модулятор иммунного ответа. Вечером он
получил первые 30 аминокислот на аминокислотном анализаторе (рис. 5-43).
Ему нужен ваш совет, как лучше клонировать ген, чтобы добиться высокого
уровня его экспрессии в бактериях. Он доказывает, что этот белок,
благодаря стимулированию имунной системы, мог бы служить отличным
средством для лечения простуды. Он и название ему уже подобрал -
иммустим.
Хотя коллега и увлекающийся человек, но он ваш друг, поэтому вы
откликаетесь на его идею, пообещав позвонить через 15 мин, как только
переведете аминокислотную последовательность в нуклеотидную. Какие два
набора олигонуклеотидов размером по 20 нуклеотидов вы порекомендуете
другу-коллеге в качестве наилучших зондов гибридизации для скрининга
библиотеки геномной ДНК?
5-53 На основе своей предыдущей работы вы предполагаете, что глутамин (Q)
в сегменте белка, изображенном на рис. 5-44, играет важную роль в
активном центре. Ваш руководитель хочет, чтобы вы изменили белок тремя
путями: заменили глутамин на лизин
10 20 30
MFYWMIGRST EDWMPLYMKD FWAKHSLICE
Рис. 5-4
ДНК и
(задача
Рис. 5-45.
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 308 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed