Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
зами BamHI и PstI узнаваемых ими - GGATCC - m ,
- G G А Т С С
последовательностей (задача 5-48). - CCTAGG - -
CCTAG G
Показаны только те нуклеотиды, 3' | 5'
которые образуют сайты узнавания.
.
5' I 3'
-- С Т G С A G - Pstl
- С Т G С A G
- G.ACGTC - -
G ACGTC
ДНК в ядро соматической клетки, где ДНК может включаться в
хромосому и таким образом сохраняться и экспрессироваться в последующих
клеточных поколениях.
5-48 Рестриктазы BamHI и PstI разрезают узнаваемые ими
последовательности, как показано на рис. 5-38.
A. Укажите, где находятся 5'- и З'-концы разрезаемых молекул ДНК.
Б. Как будут модифицироваться эти концы, если инкубировать разрезанные
молекулы ДНК с ДНК-полимеразой в присутствии всех четырех
дезоксинуклеозидтрифосфатов?
B. Могут ли концы, появившиеся в результате разрезания ферментом
BamHI, соединиться вновь при инкубации с ДНК-лигазой фага Т4 после того,
как была проведена реакция, о которой шла речь в пункте Б?
Можно ли соединить вместе концы ДНК, образовавшиеся при обработке
PstI? (Лигаза ДНК фага Т4 соединяет вместе "тупые" концы так же, как и
"липкие".)
Г. Будет ли регенерировать узнаваемый BamHI сайт, о котором шла речь в
пункте В, при соединении концов? Будет ли регенерировать сайт, узнаваемый
PstI?
5-49 Фермент рестрикции Sau3A узнает последовательность -GATC- и
расщепляет цепь ДНК на 5'-стороне (слева) от G (поскольку верхняя и
нижняя цепи большинства сайтов рестрикции читаются одинаково в
направлении от 5'- к З'-концу, только одна цепь этого сайта может быть
показана для иллюстрации). Одноцепочечные концы, возникающие при
расщеплении рестриктазой Sau3A, идентичны концам, возникающим при
расщеплении рестриктазой BamHI (рис. 5-38), что позволяет им соединяться
при инкубации с ДНК-лигазой. (Полезно нарисовать структуру продукта,
образующегося в результате такого сшивания, чтобы убедиться в том, что
она правильна.)
A. Какая доля сайтов, узнаваемых BamHI, может быть разрезана
рестриктазой Sau3A? Какая доля сайтов, узнаваемых Sau3A, может быть
разрезана рестриктазой BamHI?
Б. Если два конца, образовавшиеся при расщеплении BamHI, сшиваются
вместе, то образующийся сайт может быть снова расщеплен BamHI. То же
самое справедливо для двух концов, образующихся при расщеплении Sau3A.
Предположите, однако, что вы сшиваете конец, образовавшийся при обработке
Sau3A, с концом, образовавшимся при обработке BamHI. Может ли гибридный
сайт разрезаться рестриктазой Sau3A, рестриктазой BamHI?
B. Каков будет средний размер фрагментов ДНК, образующихся при
обработке хромосомной ДНК рестриктазой Sau3A, рестриктазой BamHI?
5-50 Вы очистили два фрагмента ДНК, образующиеся при обработке
Рис
pa j
Рис. 5-
очище]
ческое
фрагме
(задачг
Основные генетические механизмы 43
;я
;я
а-
К.
13-
ех
зм
Т4
:ЧЬ
ри
Ю"
ша
1ТЬ
ьку
тся
ого
ные
;ен-
зой
ции
об-
гься
зана I >жет i
:ши- ; рас- i , об- ( , что I кон- { дный j
I
I при газой
Рис. 5-39. Окончательная структу- BamHI BamHI
BamHI
ра гибридного гена (задача 5-50). )------400----I------------900------
----------I
I ...... I
...... I
--300 -- t -300-- 1 --------700-
----------
EcoRI EcoRI
BamHI рекомбинантной плазмидной
ДНК. Один фрагмент содержит 400 п. н., другой-900 п.н. Вы хотите
объединить их вместе, как показано на рис. 5-39, чтобы создать гибридный
ген, который в том случае, если ваши ожидания правильны, будет иметь
новые удивительные свойства.
Вы смешиваете два фрагмента в
присутствии ДНК-лигазы и инкубируете смесь. Через 30 мин после начала
инкубации и второй раз через 8 ч вы отбираете пробы и анализируете их
методом электрофореза в геле. Вас удивляет, что вместо ожидаемой
рекомбинантной молекулы размером 1,3 т.п.н. электрофоре-грамма содержит
сложный набор фрагментов (рис. 5-40, А). Вы замечаете, что при более
длительной инкубации интенсивность полос, соответствующих более мелким
фрагментам, уменьшается, а интенсивность полос, соответствующих более
крупным фрагментам, увеличивается. Если вы добавляете к смеси сшиваемых
молекул BamHI, то вновь образуются исходные фрагменты (рис. 5-40, А).
