Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
головка остается в ядре, можно было бы предположить, что ее размер
слишком велик для прохождения через ядерную пору. Однако более крупные
фрагменты нуклеоплазмина проходят через ядерные поры, поэтому возможность
пассивной диффузии этого белка следует, по-видимому, исключить.
Литература: Dingwall, С., Sharnick, S. К, Laskey, R.A. A
polypeptide domain that specifies migration of nucleoplasmin into the
nucleus. Cell 30, 449-458, 1982.
8-12 Смысл эксперимента заключается в том, что если рестриктаза EcoRI
попадет в ядро, она будет расщеплять клеточную ДНК на части, что приведет
к гибели клетки. В среде с глюкозой гибридный ген не транскрибируется и
продукт его не образуется, поэтому клетки растут очень хорошо. Однако в
присутствии галактозы гибридный ген экспрессируется. В дрожжевых клетках,
несущих плазмиду pNL~, которая кодирует нефункциональный сигнал для
импорта в ядро, гибридный белок хотя и экспрессируется, но не может войти
в ядро, поэтому он не вредит клетке. Однако в дрожжах с плазмидой pNL+,
которая кодирует функциональный сигнал для импорта, гибридный белок
попадает в ядро и разрезает клеточную ДНК, в результате чего клетки
погибают.
Литература: Barnes, G., Rine, J. Regulated expression of
endonuclease EcoRI in Saccharomyces cerevisiae: nuclear entry and
biological consequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:1354-1358, 1985.
8-13
А. Существенным недостатком вашего исходного плана является то, что
белок-убийца, образовавшийся в клетках при высокой температуре, но не
имеющий возможности проникнуть в ядро у мутантов (дефектных по механизму
переноса), по-прежнему будет присутствовать в клетках и после перенесения
их в условия
Внутриклеточная сортировка макромолекул 367
низкой температуры. Когда ядерный транспорт возобновится при
пониженной температуре, белок-убийца начнет проникать в ядро, и мутантная
клетка погибнет. Ваш первоначальный протокол гарантировал, что никакого
нового белка-убийцы не должно образовываться (под влиянием сдвига
температуры в сторону снижения и в присутствии глюкозы в среде), но в нем
не учитывалось, что часть этого белка-убийцы уже была образована в
присутствии галактозы, еще до снижения температуры.
Б. Вам следует изменить свой экспериментальный протокол так, чтобы
ранее синтезированный белок-убийца перешел бы в неактивную форму до того,
как возобновится импорт в ядро. Для этого есть много путей. Например,
можно оставить клетки при высокой температуре в среде с глюкозой (когда
не идет новый синтез) в течение длительного срока, чтобы весь ранее
синтезированный белок инактивировался в результате обычных процессов
деградации. Можно было бы также попытаться увеличить скорость такой
деградации, модифицировав N-конец белка-убийцы так, чтобы там оказалась
дестабилизирующая аминокислота (см. задачу 8-6). Такая модификация могла
бы превратить белок-убийцу в чрезвычайно короткоживущую молекулу, быстро
исчезающую при отсутствии нового синтеза. И наоборот, можно было бы
использовать чувствительный к температуре мутант, у которого EcoRI
активна при высокой и неактивна при низкой температуре. Такой
чувствительный к холоду белок окажется активным, когда ядерный транспорт
подавлен, и неактивным, когда транспорт возобновляется.
В. Есть несколько типов мутантов, которые, по-видимому, могли бы выжить
в ходе отбора, не претерпевая изменений в механизме ядерного транспорта.
Например, у мутантов с нарушением транспорта галактозы в клетку гибридный
ген не действовал бы, и в результате они выжили бы при повышении
температуры в присутствии галактозы. Выжили бы в процессе отбора и
мутанты с гибридным геном, у которых отсутствовала бы экспрессия EcoRI.
Это могли быть клетки, которые содержат мутации в промоторе
(препятствующие экспрессии гибридного гена), или мутации в EcoRI-чаети
гибридного гена (делающие EcoRI неактивной), или же мутации в той области
гибридного гена, которая ответственна за сигнал для импорта в ядро
(препятствующие импорту EcoRI в ядро).
Схемы генетического отбора редко бывают абсолютно специфичными
для искомого мутанта. В некоторых случаях могут быть предсказаны, а затем
выявлены и другие классы мутантов. В действительности, однако, наиболее
увлекательная сторона генетического отбора, которая придает ему сходство
с охотой за сокровищами, как раз и заключается в том, что часто можно
выявить такие классы мутантов, которые вы и не предполагали обнаружить.
Иногда они оказываются тривиальными и неинтересными; однако попадаются
также чрезвычайно интересные и информативные мутанты, благодаря которым
можно открыть нечто совершенно неожиданное.
Транспорт белков в митохондрии и хлоропласты
8-14
А. матрикс; внутренняя мембрана; межмембранное пространство; наружная
(внешняя) мембрана
368 Глава 8
А Пептид 1
Рис. 8-21. Спирально-круговые проекции трех пептидов (ответ 8-17).
Гидрофобные аминокислоты отмечены затемненными квадратами; заряды на
