Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
В]
П
Г€
ге
о;
Д1
НС
ся
пе
П]
ци
из
це.
Гет
Рис. i
гетер! в рез; турац бакте TnlO изобр виде 1 ные р, тами ' ными
Основные генетические механизмы 39
Рис. 5-35. Репликативная и нерепликативная транспозиция подвижного
элемента (задача 5-44). Подвижный элемент показан как гетеродуплекс,
состоящий из двух генетически различающихся цепей-одна обозначена черным
цветом, другая белым. В ходе репликативной транспозиции одна цепь
остается в донорной ДНК, а другая переносится в ДНК реципиента. При
нерепликативной транспозиции подвижный элемент вырезается из донорной ДНК
и переносится целиком в ДНК реципиента.
Tn10
tacZ +
Л Ь?:.......ltd------------
ТпЮ tacZ~
-- '-1 --I-----------------
Денатурация,
реотжиг
Гетеродуплекс Гомодуплекс
МНЯ I
I У Я- I 1-1
Рис. 5-36. Образование смеси гетеродуплексов и гомодуплексов в результате
денатурации и рена-турации двух различных геномов бактериофага лямбда,
содержащих ТпЮ (задача 5-44). Фаговая ДНК изображена линиями, а Тп10-в
виде прямоугольников. Мутационные различия между двумя элементами ТпЮ
показаны белыми и черными сегментами.
ДНК т ю
фапптмбда^
ДНК клетки-хозяина
Нерепликативная УЧ. Репликативная транспозиция /
Хтранспозиция
5-44 Вы изучаете транспозон ТпЮ, существующий в прокариотических клетках,
и придумали изящный эксперимент, с помощью которого можно выяснить,
реплицируется ли ТпЮ во время транспозиции или перемещается
безотносительно к репликации ДНК. Ваша идея основана на ключевом различии
между этими двумя механизмами: если транспозиция нерепликативная, то
должны перемещаться обе родительские цепи ТпЮ, если же транспозиция
репликативная, то должна перемещаться только одна родительская цепь (рис.
5-35). Вы собираетесь пометить отдельные цепи денатурированными цепями из
двух различных ТпЮ. Чтобы эффективно вводить эти гетеродуплексные ТпЮ в
бактерии, вы используете ДНК бактериофага лямбда, содержащую ТпЮ. Такая
ДНК может быть приготовлена in vitro, а затем упакована в капсиды, чтобы
образовался фаг, способный инфицировать клетки. Вы используете неактивный
(по причине других мутаций) фаговый геном, так что он не может
реплицироваться или встраиваться и в конце концов разрушается; таким
образом, вкладом этого фагового генома можно пренебречь.
ДНК фага несет два слабо различающихся варианта ТпЮ, встроенные
в один и тот же сайт. Оба ТпЮ содержат ген устойчивости к тетрациклину и
ген метаболизма лактозы (lacZ), но в одном из вариантов ген lacZ
инактивирован в результате мутации. Благодаря этому различию можно
следить за двумя транспозонами ТпЮ, так как колонии бактерий с геном
lacZ+ (если они инкубируются с соответствующим субстратом) становятся
синими, а колонии бактерий с геном lacZ~ остаются белыми. Вы
денатурируете и затем ренатурируете смесь двух фаговых ДНК, в результате
чего образуется смесь равных количеств гетеродуплексов и гомодуплексов
(рис. 5-36). Затем вы осуществляете упаковку этой смеси в фаговые
капсиды, заражаете lacZ~-бактерии и производите посев инфицированных
бактерий в чашки Петри на среду, содержащую тетрациклин и субстрат,
дающий окраску.
Если фаговая ДНК оказывается внутри бактерии, транспозон может
встраиваться (с очень низкой частотой) в бактериальный геном, которому он
передает свойство устойчивости к тетрациклину. Те немногие клетки,
которые приобретают ТпЮ, выживают в селективных условиях и дают колонии.
Когда вы подсчитываете большое число таких колоний, то устанавливаете,
что примерно 25% из них-белые, 25%-синие и 50%-смешанные, с одним синим и
одним белым секторами.
А. Объясните происхождение каждого вида бактериальных колоний и
сделайте заключение о том, на какой тип транспозиции указывают
приведенные выше наблюдения-репликативный или нерепликативный.
Б. Для своих экспериментов вы использовали реципиентный штамм
бактерий, который не обладал способностью к репарации по-
40 Глава 5
Рис. 5-37. Четыре перекрывающихся гена в фХ174 и соответствующая им мРНК
(задача 5-45). Пунктирными линиями отмечены две области, где
перекрываются три гена.
Полипептиды I !
Ген К
j j
Ген В
i!
| Ген А |
Матричная РНК
вреждений ДНК. Каким образом отличались бы результаты, если бы вы
использовали штамм бактерий, способных исправлять повреждения в ДНК?
В. Интегрирование ДНК бактериофага лямбда в геном бактерий с помощью
сайт-специфической рекомбинации происходит гораздо чаще, чем
транспозиция. Как отличались бы результаты от рассмотренных выше, если бы
